Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (June 2020)
121 slides from Illumina's technical presentation, Jun 17, 2020
Slide 1: ウイルスゲノムシーケンス入門: ライブラリ調製から解析まで
ウイルスゲノムシーケンス入門: ライブラリ調製から解析まで 2020年6月17日 シニアテクニカルアプリケーションサイエンティスト 渡邊 大 テクニカルアプリケーションサイエンティスト 片山 緩子 QB10174 © 2019 Illumina, Inc. All rights reserved. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 2: [kUHlc : DTIAFILY—-TFIATOVSCL
[kUHlc : DTIAFILY—-TFIATOVSCL lumina’
Slide 3: ウイルス：ゲノムの種類と特徴
ウイルス：ゲノムの種類と特徴 ゲノムタイプとウイルスの分類* ＜ウイルスの一般的な特徴＞ 二本鎖DNAウイルス ヘルペスウイルス科 ・ds/ssDNA あるいは ds/ssRNAに遺伝情報を持つ アデノウイルス科 パピローマウイルス科など ・自身では自己複製・増殖せず、宿主細胞内で増殖を行う 一本鎖DNAウイルス ・ウイルス培養には時間がかかる パルボウイルス科など ・ウイルス粒子形状、構成はウイルスによって様々 - ヌクレオカプシド 二本鎖RNAウイルス - エンベロープ レオウイルス科 - スパイク など 一本鎖RNAウイルス ・ゲノムの塩基配列のシーケンスにより、 オルトミクソウイルス科
Slide 4: ウイルスゲノム解析：変異解析による疫学研究
ウイルスゲノム解析：変異解析による疫学研究 Strain mutation event （T） Strain mutation event （A） T Viral Genome A Sequence Strain #1 Strain #2 A Strain #3 A T ウイルスゲノム上の変異情報を網羅的に得るためには、シーケンス解析が必須 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 5: 変異解析から疫学調査へ：SARS-CoV-2研究
変異解析から疫学調査へ：SARS-CoV-2研究 ●国立感染症研究所 ●Nextstrain 日本国内の562 患者のSARS-CoV-2ゲノム配列から GISAIDに登録されている世界中のウイルスゲノムデータについて ハプロタイプ・ネットワークを作成 系統樹解析などに特化したオープンソースプロジェクト。 SARS-CoV-2、Influenza, Ebola, Zikaなど 左）国立感染症研究所ホームページ 2020年4月27日公開記事 https://www.niid.go.jp/niid/ja/basic-science/467-genome/9586-genome-2020-1.htm
Slide 6: NGSによるウイルスゲノムシーケンスでわかること
NGS（次世代シーケンサー）によるウイルスゲノムシーケンスでわかること ➢ ウイルスの系統学的分類： → 特定ウイルスの検出、新規ウイルスの同定 ➢ ウイルスを構成するタンパクの情報： → ウイルス性状、病原性に関わる情報、治療薬のターゲット探索 ➢ 変異情報： → 変異株の分類、薬剤耐性株の検出、 時系列に沿った系統樹解析により拡散過程など防疫に関わる情報 → NGSによるウイルスゲノムシーケンスにより、臨床的に重要な知見を得ることができる 6 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 7: 本日のAgenda
本日のAgenda 1. シーケンス法の種類 2. ライブラリ調製とシーケンス 3. BaseSpace Sequence Hub (BSSH) を使った情報解析 4. 本日のまとめ For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 8: 1. シーケンス法の種類
1. Y-TYAKOBA illumina’
Slide 9: ウイルスゲノムシーケンス法の種類
ウイルスゲノムシーケンス法の種類 ・通常得られるサンプルには、複数種のウイルスゲノムや、宿主のDNA/RNAが含まれている ◆ Shotgun metagenomics ・微生物群のゲノムを包括的にシーケンスすることで、 複数の生物種の同定、検出を行う ・シーケンス ◆ ターゲットシーケンス ・サンプル中の特定の領域を取り出してシーケンスを行う ➢ Enrichment ・特定の領域に相補的なプローブを用いて目的の領域のみを濃縮 ・解析 - Alignment - Variant call ➢ Amplicon ・PCR法でターゲット領域を増幅する 9 For Research Use Onl
Slide 10: 各シーケンス法の特徴
各シーケンス法の特徴 ターゲットシーケンス ウイルス培養法 Shotgun Enrichment Amplicon Metagenomics サンプル・ライブラリ調製法 Culture None Hybridization PCR 新規種の検出 No No No 複数の種の検出 No Possible Possible 感度 High Variable Moderate Moderate １サンプルあたりのリード数 0.5 M 10 M 0.1-1 M 0.5 M 結果が得られるまでの時間 ++++ + ++ ++ バイオインフォマティクス解析 Easy Advanced Easy Easy
Slide 11: シーケンス解析の流れ
シーケンス解析の流れ ・ライブラリ調製： シーケンサーにかける前に、サンプルDNAの両端に 検体の採取 シーケンスに必要な配列のついた構造に加工すること DNA抽出 ライブラリの構造 RNA抽出／cDNA作成 ライブラリ調製 シーケンス シーケンスプライマーが結合するための配列 フローセルに結合するための配列 データ解析 11
Slide 12: Illuminaの提供するWorkflow (SARS-CoV-2 For Research)
Illuminaの提供するWorkflow (SARS-CoV-2 For Research) Workflow Library Prep Sequencer Fit Analysis Data Sharing NEW Shotgun Metagenomics (RNA) Requires RNA extraction followed • DRAGEN by NextSeq, NovaSeq Metagenomics TruSeq stranded total RNA NEW NEW NEW GISAID Submission Enrichment Requires cDNA followe
Slide 13: 2. ライブラリ調製とシーケンス
2. FAD SUMRBLY—FYA lumina’
Slide 14: 2-1. Shotgun Metagenomics
2-1．Shotgun Metagenomics 14
Slide 15: TruSeq Stranded Total RNAによるShotgun Metagenomics workflow例
TruSeq Stranded Total RNAによる 229E 200ng 229E 10ng (+190ng UHR) Shotgun Metagenomics workflow例 OC43 200ng OC43 10ng (+190ng UHR) ・市販のコロナウイルス2株（OC43、229E）で TruSeq Stranded Total RNAによるライブラリ調製を実施 ・各ウイルス株単独200ng、あるいは各ウイルス株10ngに ヒトレファレンスRNA（UHR）190ngを混合したサンプル からスタート ・MiSeq:2x76 bpシーケンス 5% CoV +95%UHR 100
Slide 16: (1) Shotgun Metagenomics workflow
(1) Shotgun Metagenomics workflow • TruSeq Stranded Total RNAのワークフロー • TruSeq Stranded Total RNAのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 16 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 17: (1) Shotgun Metagenomics workflow
(1) Shotgun Metagenomics workflow • TruSeq Stranded Total RNAのワークフロー • TruSeq Stranded Total RNAのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 17 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 18: TruSeq Stranded Total RNAワークフロー
TruSeq Stranded Total RNAワークフロー ① リボソームRNAの除去とRNAの断片化 ② ランダムプライマーを 用いてcDNA合成 ⑤ インデックス付アダプターのライゲーション ③ 2nd Strandの 合成とリン酸化 ⑥ PCR増幅 ④ A-Tailの付加 ⑦ ライブラリのクリーンアップ、定量、ノーマライゼーション 18 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 19: (1) Shotgun Metagenomics workflow
(1) Shotgun Metagenomics workflow • TruSeq Stranded Total RNAのワークフロー • TruSeq Stranded Total RNAのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 19 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 20: TruSeq Stranded Total RNAのプロトコル
TruSeq Stranded Total RNAのプロトコル ・TruSeq Stranded Total RNAのプロトコル詳細については、 下記日本語ウェビナー資料、Reference Guideをご参照ください 【日本語ウェビナー】 RNA-Seqをはじめよう ライブラリー調製編： 絶対に失敗しないライブラリー調製【イルミナiSchool 初級】 https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-180228-j.html ➢ 必要準備品、実験消耗品、機器情報 (p8~) ➢ 実験のプロトコル（p22~） ➢ トラブルシュート(p3
Slide 21: TruSeq Stranded Total RNA：RNA抽出に関する注意点
TruSeq Stranded Total RNA ：RNA抽出に関する注意点 ・抽出したRNAは吸光度測定し、精製度を確認してください - 260/280 Ration Value：~2.0、260/230：2.0-2.2 ・Agilent 2100 Bioanalyzer、Tape Station、もしくは同等品を使用し、 RIN値（RNA Integrity Number）でRNAの分解度を確認してください ・Input RNA量は、 10-100 ng/µlのTotal RNA 10 µL、（0.1-1μg Total RNA）です。 定量法の指定はありませんが、 蛍光色素を用いた方法
Slide 22: キットに含まれるリボソームRNAの除去試薬の種類
キットに含まれるリボソームRNAの除去試薬（Ribo-Zero）の種類 Universal Human Reference Total RNA リボソーム ・Ribo-Zero試薬により、抽出RNAに多く含まれる目的外のrRNAなどを除去することで、 RNA 不要なrRNAにアライメントされるリードが大きく減少します。 表）TruSeq Stranded Total RNAキットに含まれるRibo-Zero試薬の除去ターゲットrRNA Ribo-Zero rRNA マウス・ Removal Kit (Human/Mouse/Rat). ヒト ラット 植物 ミ ミ ミ ト ト ト コ グ コ グ
Slide 23: (1) Shotgun Metagenomics workflow
(1) Shotgun Metagenomics workflow • TruSeq Stranded Total RNAのワークフロー • TruSeq Stranded Total RNAのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 23 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 24: TruSeq Stranded Total RNA：シーケンス条件
TruSeq Stranded Total RNA：シーケンス条件 ・RNA-Seqライブラリはインサート長が150-220 bp ・各シーケンサーのインプットライブラリ量は、 各Support Bulletinではおよそ500 bpのライブラリを想定している → 短いライブラリは、クラスターを形成しやすいため、 初めてRNA-Seqをする場合、推奨濃度よりも少し控えめ（x0.7–x0.8）をお勧めします RNA-Seq Platform インプット濃度 至適クラスター密度 ライブラリインプット濃度 HiSeq 2000/2500 High OutPut v3 12.0 pM 750 - 85
Slide 25: (1) Shotgun Metagenomics workflow
(1) Shotgun Metagenomics workflow • TruSeq Stranded Total RNAのワークフロー • TruSeq Stranded Total RNAのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 25 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 26: シーケンスコスト試算：TruSeq Stranded Total RNA
シーケンスコスト試算：TruSeq Stranded Total RNAによる Shotgun Metagenomics workflow ＊サンプル採取およびRNA抽出のコストは含みません。 ●ライブラリ調製コスト：96 sampleを調製する場合 キット名 1キットあたりのサンプル数 カタログ番号 キットのコスト（円） 1サンプルあたりのコスト（円） TruSeq Stranded Total RNA Library prep 96 samples 20020599 ¥1,640,000 ¥17,083 Gold IDT for Illumina TruSeq RNA UD Indexes
Slide 27: 2-2. Enrichment
2-2. Enrichment lumina’
Slide 28: Nextera DNA Flex for Enrichmentによるworkflow例
Nextera DNA Flex for Enrichmentによる Enrichment workflow例 (A)UHRに5%市販のコロナウイルス株（OC43）RNAを混合したサンプル (B)呼吸器疾患関連DNA/RNAウイルス5種のみ、あるいはUHRに5%5種ウイルスの核酸を混合したサンプル ・Nextera DNA Flex for Enrichment と、Respiratory Virus Oligo Panelでライブラリ調製を実施 ・MiSeqで 2x151 bpのシーケンス (A) 濃縮なし 濃縮あり (A) Shotgun metagenomicsとの比較 (B) Shot
Slide 29: (2) Enrichment workflow
(2) Enrichment workflow • Nextera DNA Flex for Enrichmentとは • Nextera DNA Flex for Enrichmentのワークフロー • Nextera DNA Flex for Enrichmentのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 29 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 30: (2) Enrichment workflow
(2) Enrichment workflow • Nextera DNA Flex for Enrichmentとは • Nextera DNA Flex for Enrichmentのワークフロー • Nextera DNA Flex for Enrichmentのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 30 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 31: Nextera DNA Flex for Enrichmentの特徴
Nextera DNA Flex for Enrichmentの特徴 A: Pre-enrichment Step • Pre-enrichmentとEnrichment（濃縮） 1 sample 1 sample の2段階のワークフロー Whole library • Enrichment（濃縮）ステップは、2サンプル 以上同時に処理可能（プレ・プール方式） • 最短6.5hour*1に短縮されたプロトコル • 10-1000 ngのインプットゲノムDNAに対応 • FFPE（ホルマリン固定パラフィン標本）由来 1 sample DNA,末梢血、唾液サンプルからの Whole library
Slide 32: Nextera DNA Flex for Enrichment：製品-1
Nextera DNA Flex for Enrichment ：製品-1 【注意事項】 - Enrichment(濃縮ステップ)を、何サンプルプールしてから行うか（12サンプルプールして1回で濃縮するなら12 plex） によって、必要になるコンポーネントキット数が異なりますのでご注意ください - Nextera DNA Flex for Enrichment には、①～④の4つのコンポーネントが必要です ①ライブラリ調製試薬 ：サンプル数分 Pre-enrichment Stepで使用 ②インデックス試薬：サンプル数分 あるいは 一度にランするサンプル数分 ③濃縮試薬：Enrichment
Slide 33: Nextera DNA Flex for Enrichment：製品-2
Nextera DNA Flex for Enrichment ：製品-2 ① ライブラリ調製試薬 および ③ 濃縮試薬（下記の中からご選択ください） ①ライブラリ調製試薬 ③濃縮試薬 カタログ番号 製品名 （サンプル数） （Enrichment反応量） 旧）Nextera DNA Flex Pre-Enrichment Library Prep and Enrichment Reagents – 16 samples 20025523 16 sample 16 Enrichment 新）Illumina DNA Prep with Enrichment (S) Tagmentation 16
Slide 34: Nextera DNA Flex for Enrichment：製品-3
Nextera DNA Flex for Enrichment ：製品-3 ②インデックス製品 （下記の中からご選択ください） 【旧】 カタログ番号 製品名 ②インデックス製品 20027213 IDT® for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes Set A 96 Indexes, 96 Samples 20027214 IDT® for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes Set B 96 Indexes, 96 Samples 20027215 IDT® for Illumina Nextera
Slide 35: Nextera DNA Flex for Enrichment：製品-4
Nextera DNA Flex for Enrichment ：製品-4 ④ 濃縮用オリゴプローブパネル製品 （下記の中からご選択ください） ④濃縮用オリゴ カタログ番号 濃縮用オリゴプローブパネル製品名 プローブのターゲット Enrichment反応量 20020183 Illumina Exome Panel (CEX) ヒトコーディング領域 8 enrichments FC-121-0202 TruSight Cancer がん関連94遺伝子 8 enrichments 20029227 TruSight One 疾患関連4,813遺伝子 6 enrichments 20029226
Slide 36: (2) Enrichment workflow
(2) Enrichment workflow • Nextera DNA Flex for Enrichmentとは • Nextera DNA Flex for Enrichmentのワークフロー • Nextera DNA Flex for Enrichmentのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 36 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 37: Nextera DNA Flex for Enrichment ワークフロー
Nextera DNA Flex for Enrichmentワークフロー Pre-enrichment library prep Enrichment library prep ① cDNAの断片化とタグメンテーション ⑤ パネルプローブのハイブリダイゼーション ② PCRによるインデックスアダプターの付加 ⑥ ビーズによるプローブ結合ライブラリの濃縮と溶出 ③ ライブラリの溶出、クリーンアップ ⑦ PCRによる選択されたライブラリプールの増幅 ④ ライブラリの定性、定量とプーリング ⑧ プールしたライブラリの定性、定量 37 For Research Use Only. Not for u
Slide 38: (2) Enrichment workflow
(2) Enrichment workflow • Nextera DNA Flex for Enrichmentとは • Nextera DNA Flex for Enrichmentのワークフロー • Nextera DNA Flex for Enrichmentのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 ＊このセクションではNextera DNA Flex for Enrichment の標準プロト コルをご紹介していますが、Respiratory Virus Oligos Panelと組み合わ せてコロナウイルス株をサンプルとした社内実験の際の情報を、 Corona • コスト試算 Vi
Slide 39: Nextera DNA Flex for Enrichment：準備品(抜粋)
Nextera DNA Flex for Enrichment ：準備品(抜粋) 製品名 製造販売元 型番 容量 A63880 5 ml Agencourt AMPure XP kit Beckman Coulter 精製ステップで使用 A63881 60 ml Q32850 100 assay Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Fisher Q32853 500 assay ライブラリQCで使用 Agilent DNA 1000 Kitなど Agilent 5067-1504 25 Chip 製品名 製造販売元 型番 Agilent 2100 Bioanalyz
Slide 40: Input DNAに関する注意点
Nextera DNA Flex for Enrichment : Input DNAに関する注意点（genomic DNAサンプルの場合） ・Genomic DNAの場合：推奨input量は 50-1000 ngです 【重要】 （30 μl inputの場合、1.67 ~ 33.3 ng/μl） Input DNAに以下のものが含まれないこと 10-49 ngの場合は、蛍光色素を用いた方法で定量を行ってください ・1mM以上のEDTA ・イルミナから推奨する特定のDNA抽出キットはありません ・有機化合物（フェノール、エタノールなど） 30 μl input DNAからスタートですので、それ
Slide 41: Corona virus検出時のInput DNAとプロトコル
Corona Virus Nextera DNA Flex for Enrichment Protocol Corona virus検出時のInput DNAとプロトコル (Respiratory Virus Oligos Panel) ・cDNA作成へのRNA持ち込み量は、最少で10 ngを推奨します ・推奨する特定のRNA抽出・cDNA合成キットはありませんが、社内テストでは下記キットを使用しています 製品名 製造販売元 型番 QIAmp Viral RNA Mini Kit (50 samples) QIAGEN 52904 QIAmp Viral RNA Mini Kit (250 s
Slide 42: プロトコル①：cDNAの断片化とタグメンテーション
Pre-enrichment library prep Nextera DNA Flex for Enrichment プロトコル①： cDNAの断片化とタグメンテーション (1) サンプル（50-1000ng）を30 μLずつPCR plateに用意する ★(2)で使用するtagmentation (2) tagmentation ｍaster mix★を20 μL添加してよくピペッティング ｍaster mix Reagent 1 rxn (3) プログラム名：TAG program eBLT 11.5 µl 55℃, 5 分 TB1 11.5 µl 10℃, hold Total Vol
Slide 43: ②PCRによるインデックスアダプターの付加
Pre-enrichment library prep Nextera DNA Flex for Enrichment ② PCRによるインデックスアダプターの付加 (1) PCR master Mixを調製する ★PCR master Mix (2) ①のTWB Bufferでのwashを完了させる Reagent 1 rxn （透明になった上清を除く）→マグネットスタンドから外す EPM 23 µl ★ビーズを乾燥させないこと Nuclease-free water 23 µl (3) すぐにPCR master Mix 40 μlを加える Total Volume 46 µl → すぐに
Slide 44: ③ライブラリの溶出、クリーンアップ
Pre-enrichment library prep Nextera DNA Flex for Enrichment ③ ライブラリの溶出、クリーンアップ 実験のポイント：クリーンアップ (1) マグネットスタンドにセットして45 μl の上清を回収 - 2-Step クリーンアップなので間違えないこと (2) AMPure XP Beadsを使用したクリーンアップ 1st Clean up- Large fragmentを除く * High quality gDNA, blood and saliva samplesの場合 →上清を回収 - 77 μl のnuclease free wat
Slide 45: 参考：AMPure XP BeadsによるClean up
実験のポイント 参考：AMPure XP BeadsによるClean up 実験のポイント：AMPure XP Beads - 実験前に室温に戻しておくこと 核酸溶液とAMPure XP Beadsの体積比によって - Vortexをして完全にSuspendしておくこと ビーズ上に結合して回収される核酸のサイズが変わりますので、 - 乾燥しすぎないよう、Reference Guideの ビーズに対するDNA溶液の体積比が非常に重要です。 乾燥時間は参考程度に - 正確なピペッティングが重要 ＊AMPure XP Beadsに 結合するライブラリサイズ ＜AMPure XP Beadsの取り扱い
Slide 46: ④ライブラリの定性、定量とプーリング
Pre-enrichment library prep Nextera DNA Flex enrichment ライブラリ： Nextera DNA Flex for Enrichment Pre-enrichment終了時のトレース例 ④ ライブラリの定性、定量とプーリング (1) 15 μl のサンプル中、1 μlをBioanalyzerでの定性に使用 (2) 体積比によるプール方法か、質量比によるプール方法のどちらかで、 Total 30 μlのライブラリプールを作成 ★想定ライブラリサイズはおよそ300-400bp FFPEサンプルの場合は少し小さくなり、250bp ★定量は、1 μl
Slide 47: ⑤パネルプローブのハイブリダイゼーション
Enrichment library prep Nextera DNA Flex for Enrichment ⑤ パネルプローブのハイブリダイゼーション (1) プールサンプル30 μl に、NHB2、プローブパネル、EHB2を、 この順番に添加してピペッティング 実験のポイント：NHB2 Reagent 1 tube Pooled/1-plex library 30 μl - -20℃保存においては沈殿が発生 NHB2 50 µl →完全な溶解が必須 - 室温で解凍後、50℃5分加熱 Oligo probe panel 10 μl - Vortexとピペッティングを繰り返して、 EHB2
Slide 48: ⑥ビーズによるプローブ結合ライブラリの濃縮と溶出
Enrichment library prep Nextera DNA Flex for Enrichment ⑥ ビーズによるプローブ結合ライブラリの濃縮と溶出 (1) ハイブリダイズ後のサンプル100 μl にSMB 250 μlを添加し混合 ★Corona Virus ★FFPEサンプル、CEXパネル、 protocol (2) MIDI Heat Blockerに移し、62℃(★) 15分インキュベーション Somatic Variant callingの 58℃を → この間にEEWを62℃(★)に温めておく 場合は 全て58℃ 選択してください （＊Washが終わるまでEEWの温度
Slide 49: ⑦PCRによる選択されたライブラリプールの増幅
Enrichment library prep Nextera DNA Flex for Enrichment ⑦ PCRによる選択されたライブラリプールの増幅 (1) 25 μl のenrichedライブラリに5 μl PPC、20 μl EPMをこの順に加える ★CEXパネルの場合は10 cycleを推奨。 (2) Program名：AMP ★最終ライブラリQCは、1 μlをもちいて サードパーティ製オリゴプローブを使用の場合は、 98℃, 30秒 Qubit dsDNA BR Assay kitでの定量、 Reference Guideをご確認ください 98℃, 10秒 1 μlを用いて
Slide 50: (2) Enrichment workflow
(2) Enrichment workflow • Nextera DNA Flex for Enrichmentとは • Nextera DNA Flex for Enrichmentのワークフロー • Nextera DNA Flex for Enrichmentのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 50 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 51: Nextera DNA Flex for Enrichment：シーケンス条件
Nextera DNA Flex for Enrichment ：シーケンス条件 ・ライブラリの調製後、下記のスタート濃度から、各装置の推奨希釈プロトコルを開始してください。 ・最終ライブラリ濃度の最適化が必要な場合があります。 Platform ライブラリ希釈スタート濃度 インプット時最終ライブラリ濃度 HiSeq 2000/2500 (high output modes) 2 nM 16 – 18 pM HiSeq 2500 System (rapid run mode) 2 nM 7 – 8 pM HiSeq 3000/4000 2-3 nM 150 – 200 pM iSeq 100
Slide 52: (2) Enrichment workflow
(2) Enrichment workflow • Nextera DNA Flex for Enrichmentとは • Nextera DNA Flex for Enrichmentのワークフロー • Nextera DNA Flex for Enrichmentのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 52 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 53: シーケンスコスト試算：Enrichment workflow
シーケンスコスト試算： Nextera DNA Flex for Enrichmentと Respiratory Virus Oligo PanelによるEnrichment workflow ●ライブラリ調製コスト：96 sampleを調製する場合 ＊サンプル採取およびRNA抽出、cDNA作成のコストは含みません。 キット名 1キットあたりのサンプル数 カタログ番号 キットのコスト（円） 1サンプルあたりのコスト（円） Illumina DNA Prep with Enrichment (S) 96 samples 20025524 ¥1,306,900 ¥13,614 Tagmentati
Slide 54: 2-3. Amplicon
2-3. Amplicon lumina’
Slide 55: Amplicon workflowの種類について
Amplicon workflowの種類について ●PCR Ampliconを複数設計することで、 ゲノム上の複数の領域、 あるいはゲノムの全長をライブラリ化することが可能 genome ● SARS-CoV-2の場合 ・複数のアンプリコンでゲノム全長をカバーするWGS tiling法が主に用いられている ・一般的に用いられている3rd Partyのtiling法 - ARTIC法： 98 PCR ampliconsのプライマーがV3までWEBで公開されている https://artic.network/ - ARTIC法をベースとした改変版プロトコル（日本国立感染研究所） https://w
Slide 56: (3) Amplicon workflow
(3) Amplicon workflow • AmpliSeq for Illumina SARS-CoV-2 Research Panel • AmpliSeq for Illuminaのワークフロー • AmpliSeq for Illuminaのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 56 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 57: (3) Amplicon workflow
(3) Amplicon workflow • AmpliSeq for Illumina SARS-CoV-2 Research Panel • AmpliSeq for Illuminaのワークフロー • AmpliSeq for Illuminaのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 57 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 58: AmpliSeq for Illumina SARS-CoV-2 Research Panel
AmpliSeq for Illumina SARS-CoV-2 Research Panel • 247 Amplicon（125-275 bp、2 pool）でSARS-CoV-2 ゲノムの全長をカバー （増幅コントロールとしてHuman 5 geneをターゲットとしたAmpliconも含まれる） • 網羅的かつ高感度で低コストな変異解析を実現 • イルミナコンシェルジュサービスを使用することで、カスタムでアンプリコンを追加することが可能 AmpliSeq SARS-CoV-2 panelのAmpliconをUCSC Genome Browserで展開 58 For Research Us
Slide 59: (3) Amplicon workflow
(3) Amplicon workflow • AmpliSeq for Illumina SARS-CoV-2 Research Panel • AmpliSeq for Illuminaのワークフロー • AmpliSeq for Illuminaのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 59 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 60: AmpliSeq for Illumina (DNA/RNA)のワークフロー
AmpliSeq for Illumina (DNA/RNA)のワークフロー DNA RNA ⓪ 逆転写cDNA合成 ① ターゲット領域の増幅（PCR） ② プライマー部分を分解（FuPa処理） ③ インデックス-アダプターのライゲーション および ライブラリーの精製（AMPureビーズ精製） 所用時間5-7時間 ④ ライブラリーの増幅（PCR）および （ハンズオン1.5時間） 精製（AMPureビーズ精製×2） 60 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 61: AmpliSeq for Illuminaの注意点: プール数と反応数
AmpliSeq for Illumina の注意点: プール数と反応数 ・Amplicon数が多い場合、最初のPCR反応を分けて行う必要があります ・プール数＝1サンプル当たりのPCR反応チューブ数 ・反応数＝ Library PLUS 試薬の消費単位 Primer set A Primer set B Amplicon Amplicons PCR反応を2つのチューブに分けて行った場合 ① ターゲット領域の増幅 → 2 pool genome ② プライマー部分を分解 以降 PCR反応を1つのチューブで行った場合 → 1チューブにまとめて1反応 【注意点】 • 1プールは最大3,072アンプ
Slide 62: AmpliSeq SARS-CoV-2 Panel実験に必要な製品
Corona Virus Protocol AmpliSeq SARS-CoV-2 Panel実験に必要な製品 (AmpliSeq for illumina SARS- CoV-2 Research Panel) ⚫①～④の4つの製品を個別にご購入いただく形になります AmpliSeq cDNA Synthesis （cDNA変換試薬） （100反応分） AmpliSeq for illumina SARS- CoV-2 Research Panel （2,250反応分、247Amplicon, 2 pool） AmpliSeq Library PLUS試薬 （24 反応、96 反応、384
Slide 63: (3) Amplicon workflow
(3) Amplicon workflow • AmpliSeq for Illumina SARS-CoV-2 Research Panel • AmpliSeq for Illuminaのワークフロー • AmpliSeq for Illuminaのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 63 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 64: AmpliSeq for Illuminaのプロトコル
AmpliSeq for Illuminaのプロトコル AmpliSeqのライブラリ調製の詳細に関しては、下記の日本語ウェビナーおよびReference Guideをご参照ください 【日本語ウェビナー】 AmpliSeq for Illumina パネル解析をはじめよう -製品紹介とライブラリー調製編-【イルミナiSchool 初級】 https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-180425-j.html ➢ 必要準備品（p36~） ➢ Input DNA、RNAの条件 (p42~) ➢ プロトコル（p46~） ➢ トラブルシュート（
Slide 65: プロトコル⓪ Input RNAと逆転写cDNA合成
Corona Virus AmpliSeq SARS-CoV-2 Panel Protocol プロトコル⓪ Input RNAと逆転写cDNA合成 ● Input RNAの条件 実験のポイント：Input RNA • 20～50 ng/μlの濃度で保管 • 標準使用量は10 ng/pool (high quality RNA 1-100 ng) - DNase処理をしておく - RNA溶解バッファーは高濃度の • 7 μl以下に溶出する必要があります EDTAなど、PCR反応を阻害する試 • Qubit RNA HS Assay kitなど、蛍光色素を用いた方法で定量 薬が入っていないバッフ
Slide 66: プロトコル①：ターゲット領域の増幅（PCR）
Corona Virus AmpliSeq SARS-CoV-2 Panel Protocol プロトコル①：ターゲット領域の増幅（PCR） Primer set Primer Set (1) 5xAmpliSeq HiFi MixとStep⓪で作成したcDNA、および Pool 1 Pool 2 Nuclease-free water を混合し、Master mix(★)を作成 (2) 2 wellに Master mixを 8 μlずつ分注する ★Master Mix (3) 片方のwellに5xAmliSeq SARS-CoV-2 panel Pool 1 を2 μl, Reagent
Slide 67: プロトコル②：プライマー部分を分解（FuPa処理）
Corona Virus AmpliSeq SARS-CoV-2 Panel Protocol プロトコル②：プライマー部分を分解（FuPa処理） (1) Pool１(10 μl)とPool２(10 μl) を混合（total 20 μl) Primer pool1 Primer Pool2 Amplicons Amplicons (2) FuPa 試薬 2 ulを加えて、混合 (total 22 μl) (3) Program名: FUPA 50℃, 10 分 55℃, 10 分 FuPa Reagent 62℃, 20 分 10℃, hold ★プロトコル③以降は、下記資料をご参照ください
Slide 68: (3) Amplicon workflow
(3) Amplicon workflow • AmpliSeq for Illumina SARS-CoV-2 Research Panel • AmpliSeq for Illuminaのワークフロー • AmpliSeq for Illuminaのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 68 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 69: AmpliSeq for Illumina Custom Panel：シーケンス条件
AmpliSeq for Illumina Custom Panel：シーケンス条件 ・ライブラリの調製後、下記のスタート濃度から、各装置の推奨希釈プロトコルを開始してください。 ・最終ライブラリ濃度の最適化が必要な場合があります。 ・2 x 151 bpでのランを推奨します。 Platform ライブラリ希釈スタート濃度 インプット時最終ライブラリ濃度 iSeq 100 2 nM 50 pM MiniSeq 2 nM 1.1 – 1.9 pM MiSeq (v3 reagents) 2 nM 7 - 9 pM NextSeq 500/550 2 nM 1.1 – 1.9 pM ★Corona
Slide 70: (3) Amplicon workflow
(3) Amplicon workflow • AmpliSeq for Illumina SARS-CoV-2 Research Panel • AmpliSeq for Illuminaのワークフロー • AmpliSeq for Illuminaのプロトコルと注意点 • シーケンス条件 • コスト試算 70 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 71: シーケンスコスト試算：Amplicon workflow
シーケンスコスト試算： AmpliSeq SARS-CoV-2 Panelによる Amplicon workflow ＊サンプル採取およびRNA抽出のコストは含みません。 ●ライブラリ調製コスト：96 sampleを調製する場合 キット名 1キットあたりのサンプル数 カタログ番号 キットのコスト（円） 1サンプルあたりのコスト（円） Ampliseq™ cDNA Synthesis for Illumina 100 reactions 20022654 ¥59,000 ¥590 AmpliSeq™ SARS-CoV-2 Research Panel for 2,250 reactions 20
Slide 72: 3．BaseSpace Sequence Hub (BSSH) を使った情報解析
3．BaseSpace Sequence Hub (BSSH) を使った情報解析
Slide 73: BaseSpaceで利用可能なSARS-CoV-2解析ツール
BaseSpaceで利用可能なSARS-CoV-2解析ツール Tool/Pipeline Overview Price NEW • ホストゲノムの除去、Kraken 2を使用した分類同定 DRAGEN Metagenomics • Krona plotなど視覚的にわかりやすい解析レポートの生成 検出・同定 NEW DRAGEN RNA Pathogen • Respiratory virus panel for Nextera Flexが使用可能 Detection • DRAGEN k-mer matcherを使用したウイルス検出 10月までアプリ 使用料無料 NEW GISAID Subm
Slide 74: BaseSpaceで利用可能なSARS-CoV-2解析ツール
BaseSpaceで利用可能なSARS-CoV-2解析ツール Tool/Pipeline Overview Price DRAGEN Enrichment • Nextera Flex + Respiratory Virus Panelに対応 • 5 iCredit /node hr DNA Amplicon • AmpliSeq for Illumina + AmpliSeq Coronavirus Panelに対応 • 3 iCredit /node hr 引き続きアップデートや新規リリースが見込まれます 74 For Research Use Only. Not for use in d
Slide 75: Illumina Workflows
Illumina Workflows Workflow Library Prep Sequencer Fit Analysis Data Sharing Shotgun NEW Metagenomics (RNA) Requires RNA extraction followed by NextSeq, NovaSeq • DRAGEN Metagenomics TruSeq stranded total RNA NEW NEW GISAID Submission Enrichment Requires cDNA followed by iSeq, MiniSeq, MiSeq • DRAGE
Slide 76: 3-1. 解析ツール
3-1. NDUYIF—-9 illumina’
Slide 77: パブリックデータのご用意
パブリックデータのご用意 データ名 内容 ・Nextera Flex for Enrichment, Respiratory Virus Panel reference file Respiratory Virus Panelのリファレンスfastaとbedファイル NFE_CoVOC43_95UHR ・OC43株5% + UHR 95%, NFE + RVSパネルで濃縮 _Enriched ・Dragen Metagenomicsアプリの実行例 NFE_CoVOC43_95UHR ・OC43株5% + UHR 95%, NFEライブラリ _Unenriched ・Dragen Metagen
Slide 78: サンプルプロジェクト
サンプルプロジェクト データ名 入手場所 内容 DRAGEN Metagenomics アプリのトップページから ・アプリのデモラン（de-host ON/OFFなど） Sample Project DRAGEN RNA Pathogen ・アプリのデモラン（異なるリファレンスでの実行結 Detection Sample アプリのトップページから 果など） Project ・SFS参考リファレンスのダウンロード 引き続きアップデートが見込まれます 78 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 79: DRAGEN Metagenomics Pipeline
DRAGEN Metagenomics Pipeline ショットガンメタゲノムワークフロー
Slide 80: DRAGEN Metagenomicsアプリワークフロー
DRAGEN Metagenomicsアプリワークフロー 01 DRAGENを使用したホストゲノムの除去 (optional) ▪ リファレンスゲノムにマッピングされたホストシーケンスを除去 02 Kraken2を使用した分類・同定 ▪ サンプル中に存在する微生物群を分類・同定 ▪ 最新のリファレンスを用意 03 レポート生成 ▪ Krona plots, QCメトリクス、検出 結果のレポートなど ▪ 視覚的にわかりやすいフォーマット 80 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 81: インプットフォーム
インプットフォーム Reference Database - MiniKraken2 - Extended Kraken2 Dehosting Dragenによるホストの除去を実行するか Organism Detection report, Organism Identifier 実行レポートのサンプル名の指定 81 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 82: 結果サマリー CoV2_Enriched
結果サマリー CoV2_Enriched サンプル名 分類群名 検出の様子 82 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 83: Sample identifierの指定
Sample identifierの指定 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi NCBI Taxonomy Browserで参照できる名称 83 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 84: Sample identifierの指定
Sample identifierの指定 アプリが認識できるフォーマット 84 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 85: レポート
レポート エクセル形式のレポート サンプル情報 85 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 86: レポート：Krona plot
レポート エクセル形式のレポート Krona plot サンプル情報 86 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 87: レポート
レポート ルートを変更し、対象を絞り込んでいくことができる 87 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 88: アプリケーションによる検出量差異 De-hosting OFF
アプリケーションによる検出量差異 De-hosting OFF ウイルス株 ウイルス株 RVS Enriched OC43: 49% 1.7M / 3.6M reads バクテリア: 42% ヒト: 19% バクテリア: 17% OC43: 5% 0.3M / 5.1M reads ウイルス株+UHR ウイルス株 RVS Enriched +UHR ヒト: 27% ヒト: 44% OC43: 35% バクテリア: 46% バクテリア: 17% 1.3M / 3.8M reads OC43: <0.05% 88 For Research Use Only. Not for use in diag
Slide 89: リファレンスの選択 CoV2_Enriched
リファレンスの選択 CoV2_Enriched OC43: 93% OC43: 50% MiniKraken2: 15min Extended Kraken2: 52min 89 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 90: De-hostingの有無 CoV2+UHR
De-hostingの有無 CoV2+UHR バクテリア ヒト OC43 バクテリア De-hosting ON 12min De-hosting OFF 29min 1,136 / 3,580 reads after De-hosting 1,423 / 4,613,308 reads 90 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 91: DRAGEN RNA Pathogen Detection Pipeline
DRAGEN RNA Pathogen Detection Pipeline エンリッチメントワークフロー 注）資料内テスト解析には仮のデータを使用したため、実際のパイプラインの実施時とは数値などが異なる場合がございます 91
Slide 92: ワークフロー
ワークフロー Human Reads Alignment & Consensus FASTA Reads Alignment Viral (Submittal to (FASTQ) (human + virus) Reads variant calling external DBs) Virus detection (using coverage) • DragenのRNA-seqパイプラインエンジンを使用 • ヒトhg38に、下記を追加した情報を選択することができる • Content from Illumina Respiratory Virus Panel • 168 viral seq
Slide 93: インプットフォーム
インプットフォーム Reference - Human (hg38) and Illumina Respiratory Virus Panel - Human (hg38) and Respiratory Viruses from the Seatlle Flu Study K-mer Analysis K-mer解析の実行について指示 Accession list for coverage plots and FASTA generation コンセンサスファスタの参照配列 93 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedu
Slide 94: 結果サマリー
結果サマリー 分類群名 サンプル名 検出の様子 94 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 95: OC43ゲノムのカバレッジ
サンプル情報 >5x 以上でOC43ゲノムのほぼ100%をカバーしているシーケンス結果 と読み取ることができる 95 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 96: コンセンサスFASTA
コンセンサスFASTA SRR11801823_Genome-Sequence-of-SARS-CoV-2 とのコンセンサスFASTA抜粋 C>T SRR11247076_RNA-Seq-of-Severe-acute-respiratory-syndrome -coronavirus-2とのコンセンサスFASTA抜粋 A>C デフォルトだとMN908947.3の配列情報を参照し、変異情報を含めたFASTAファイルとして体裁の整った 29,903塩基のコンセンサスFASTAを自動生成する For Research Use Only. Not for use in diagnostic proc
Slide 97: アライメントと変異コール
アライメントと変異コール マッピング／アライメントメトリクス （一部分のみ表示） 97 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 98: アライメントと変異コール
アライメントと変異コール マッピング／アライメントメトリクス （一部分のみ表示） 変異コールメトリクス （一部分のみ表示） 98 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 99: アライメントと変異コール
アライメントと変異コール ◀Respiratory Virus Panelのfastaファイルをリファレンスに使用 99 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 100: アライメントと変異コール
アライメントと変異コール SRR11801823_Genome-Sequence-of-SARS-CoV-2 とのコンセンサスFASTA抜粋 C>T Fastaファイルに記載がない、マッピングメトリクス の詳細を確認することも可能 100 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 101: DRAGEN Enrichment workflow
DRAGEN Enrichment workflow エンリッチメントワークフロー 注）資料内テスト解析には仮のデータを使用したため、実際のパイプラインの実施時とは数値などが異なる場合がございます
Slide 102: インプットフォーム
インプットフォーム Custom DRAGEN Reference File Respiratory Virus Reference File プロジェクト内 - RespiratoryVirus_hg38_DNA.v8.tar Custom FASTA Reference File Respiratory Virus Reference File プロジェクト内 - RespiratoryVirus.20200409.fa - RespiratoryVirus_hg38.20200409.fa Target Regions, Custom Target BED File Respirator
Slide 103: アウトプット
アウトプット ◀リード情報 ◀濃縮ステップのメトリクス 103 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 104: アウトプット
アウトプット ◀リード情報 ◀濃縮ステップのメトリクス SNV, indelメトリクス▶ 104 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 105: アウトプット
アウトプット ◀リードカバレッジ情報 105 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 106: アウトプット
アウトプット ◀リードカバレッジ情報 インサート長解析▶ 106 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 107: アライメントと変異コール
アライメントと変異コール ◀Respiratory Virus Panelのfastaファイルをリファレンスに使用 107 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 108: DNA Amplicon app
DNA Amplicon app アンプリコンワークフロー 注）資料内テスト解析には仮のデータを使用したため、実際のパイプラインの実施時とは数値などが異なる場合がございます
Slide 109: プロダクトファイルの取得とインポート
プロダクトファイルの取得とインポート https://jp.illumina.com/products/by-brand/ampliseq/community-panels/sars-cov-2.html （現在BaseSpace上にプロダクトファイルはありません） 109 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 110: インプットフォーム
インプットフォーム Custom Genome ウェブからダウンロードしたSARS-CoV-2パネル用の FASTAファイルを選択 Targeted Amplicons カスタムパネルを選択 Custom Manifest File ウェブからダウンロードしたSARS-CoV-2パネル用の マニフェストファイルを選択 110 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 111: アウトプット
アウトプット ◀リード情報 ◀アライメントメトリクス 111 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 112: アウトプット
アウトプット SNV, indelメトリクス ▼ ◀リード情報 ◀アライメントメトリクス カバレッジメトリクス▶ 112
Slide 113: アウトプット
アウトプット ◀SARS-CoV-2 Panelのfastaファイルをリファレンスに使用 113
Slide 114: Collaboration Tools
Collaboration Tools illumina’
Slide 115: BaseSpaceで行うデータシェア
BaseSpaceで行うデータシェア Push-button submission to public Easy Sharing & Collaboration infectious disease databases 115 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 116: SRAインポートアプリ
SRAインポートアプリ SRAのアクセッション番号を入れる 116 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 117: GISAIDサブミッションアプリ
GISAIDサブミッションアプリ BaseSpace Sequence Hub Lab DRAGEN RNA Create Pathogen Detection consensus FASTAs Automated run upload Collect metadata: location, etc. Targeted or WGS GISAID Create output files Submission App in desired formats Automated data GISAID upload 117 For Research Use Only. Not for use
Slide 118: GISAIDサブミッションアプリ
GISAIDサブミッションアプリ ご使用にはGISAIDアカウントの取得が必要です Metadata file CSV形式のメタデータを指定 Choose Source of Consensus FASTAs 既存のコンセンサスFastaか、リファレンスとvcfを指定 してコンセンサスFastaを作成するか Consensus sequences for upload 既存のFastaを指定する際に使用 Variant files, Reference genome 変異情報を指定 118 For Research Use Only. Not for use in diagnostic pro
Slide 119: 4. 本日のまとめ
4. FHDECH lumina
Slide 120: 本日のまとめ
本日のまとめ • イルミナ社はSARS-CoV-2を含めた、様々なウイルスゲノムシーケンスに対 応したライブラリ調製キット、シーケンサー、解析ツールをご提供しています • TruSeq Stranded Total RNAによるShotgun Metagenomics法 • 新製品のRespiratory Virus Oligo Panel、 AmpliSeq for Illumina SARS-CoV-2 Research Panelを用いてターゲットシーケンス を手軽に実現 • BaseSpaceには、検出、同定、変異解析に使用できるアプリがある • 公共データベースとの共有もアシストする
Slide 121: CHRD OMCICEWELE.
CHRD OMCICEWELE. illumina’