Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (January 2019)
45 slides from Illumina's technical presentation, Jan 30, 2019
Slide 1: パネル解析をはじめよう
パネル解析をはじめよう ～解析目的に合わせた実験デザインの構築～ 高田 よう子 イルミナ株式会社・テクニカルアプリケーションサイエンティスト 寺倉 伸治 イルミナ株式会社・フィールドアプリケーションサイエンティスト January 30, 2018 © 2017 Illumina, Inc. All rights reserved.
Slide 2: 本日の Outline
本日の Outline 1. パネル解析の概要 2. アンプリコン法について：AmpliSeq for Illumina 1. ワークフロー 2. パネルの種類 3. コスト 3. キャプチャー法について：Nextera Flex for Enrichment 1. ワークフロー 2. パネルの種類 3. コスト 4. パネル解析のシーケンスデザインを考える 2 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 3: Illumina
NAIVE ORE 3 illumina’
Slide 4: パネル解析とは？
パネル解析とは？ 全ゲノム解析 パネル解析 ＝ゲノム全領域をシーケンス ＝標的領域のみをシーケンス 長所 長所 • ゲノムすべての領域が解析で • コストが安い きる • 標的領域を絞っているので情報解析 • 前処理(ライブラリー調製)が が簡便 簡便 • 高いカバレッジの解析が可能（低頻 度の体細胞変異の検出など） 短所 • シーケンスコストが高い 短所 • カバレッジが低くなる • 標的領域しか読まない • ゲノム全領域を解析するため • 前処理（ライブラリ調製）が煩雑 情報解析が煩雑 4 For Research Use Only. Not for use in diagnostic p
Slide 5: パネル解析のためのライブラリー調製手法
パネル解析のためのライブラリー調製手法 「アンプリコン法」と「キャプチャー法」 アンプリコン法 キャプチャー法 サンプル ↓ サンプル ショットガンライブラリ ↓ ↓ マルチプレックスPCR プローブによる ハイブリ・キャプチャー AmpliSeq for illumina Nextera Flex for Enrichment 5 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 6: 「アンプリコン法」と「キャプチャー法」の比較
「アンプリコン法」と「キャプチャー法」の比較 • 簡便な手法 • やや複雑な手法 特徴 • 狭い範囲を解析 • 広い範囲を解析 • 必要サンプル量は少なめ • 必要サンプル量は多め ライブラリ • AmpliSeq for Illumina • Nextera Flex for 調製試薬 Enrichment • Cancer Hotspot v2 • TruSight One パネル例 • Focus • TruSight Cardio • Comprehensive v3 • Exome 6 For Research Use Only. Not for use in diagnostic
Slide 7: AmpliSeq for Illuminaの紹介
アンプリコン法 AmpliSeq for Illuminaの紹介 1. ワークフロー 2. パネルの種類 3. コスト 7 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 8: アンプリコン法： AmpliSeq for Illumina
標的配列を読むためのライブラリー調製手法 アンプリコン法： AmpliSeq for Illumina アンプリコン法 キャプチャー法 サンプル ↓ サンプル ショットガンライブラリ ↓ ↓ マルチプレックスPCR プローブによる ハイブリ・キャプチャー AmpliSeq for illumina Nextera Flex for Enrichment 8 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 9: AmpliSeq for Illuminaに必要なサンプル量など
AmpliSeq for Illuminaに必要なサンプル量など ⚫ インプット：DNA、RNA DNA→変異・バリアント解析 RNA→発現解析、融合遺伝子検出 ⚫ 必要核酸量 高品質DNA/RNA：1 ～100 ng ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプル由来の DNA/RNA：10 ～100 ng ⚫ 作業時間：5~7時間（ハンズオン1.5時間） ⚫ イルミナでシーケンサー内蔵の解析ソフトウェアやクラウド環境での専 用の解析ツールを提供しており、簡単に解析が可能 9 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedur
Slide 10: AmpliSeq for Illuminaのワークフロー
AmpliSeq for Illuminaのワークフロー DNA RNA Reverse transcribe DNA/cDNA AmpliSeq Panel （標的領域を増幅 amplicon するプライマー） Remove primer sequences Library PLUS Ligate adapters （ライブラリー 調製に必要な 反応酵素） PCR amplify Index plate Sequencing-ready library （サンプルごとにイ ンデックスを付加） 1–100 ng インプット 合計5 – 7 時間 ハンズオン1.5 時間 推奨 – 10ng /
Slide 11: AmpliSeq for Illumina パネルポートフォリオ
AmpliSeq for Illumina パネルポートフォリオ カタログパネル コミュニティパネル カスタムパネル 11 30 合成済 受注生産 受注生産 デザイン済みのパネル デザイン済みのパネル お客様がデザインする製品 疾患研究をリードする研究者 お客様の興味のある遺伝子・ Comprehensive Cancer ゲノム領域をターゲット からの情報をもとに選択され、 Cancer Hotspot v2 デザインされたコンテンツ ＊パネルの性能は、保証外 Focus ＊パネルの性能は、保証外 Comprehensive v3 16 遺伝性疾患 On-Demandパネル BRCA 5 が
Slide 12: カタログパネル一覧
カタログパネル一覧 サンプルの カタログパネル ターゲット 種類 Comprehensive Cancer 既知のがん関連409遺伝子の体細胞変異 既知がん関連50遺伝子のホットスポット領域の Cancer Hotspot v2 体細胞変異 DNA Exome 59Mbのエクソン領域の生殖細胞系列変異 BRCA1とBRCA2の全エクソン領域および隣接イント BRCA ロン配列の体細胞変異と生殖細胞系列変異 腫瘍免疫系相互作用に関与する395遺伝子におけるが Immune Response んバイオマーカーの発現 Immune Repertoire Plus RNA T細胞受容体(TCR)の多様
Slide 13: カスタムパネルとOn-Demandパネルの違い
カスタムパネルとOn-Demandパネルの違い Custom On-Demand アプリケーション • がん、遺伝性疾患、体細胞また • 約5,000のヒト遺伝性疾患関連 は生殖細胞由来の変異解析 遺伝子にフォーカス アンプリコンサイズ • 140 bp (FFPE対応) • 275 bp • 175 bp (FFPE対応) • 275 bp • 375 bp (MiSeqのみ) パネルサイズ • 10プール、24,000アンプリコン • 2プール、500遺伝子まで （およそ1,200遺伝子） 製品構成 • 96アンプリコンまで – 750反応 • 24または96反応 • 96アンプリコン以上
Slide 14: On-Demandパネルは専用ウェブサイトでデザイン
On-Demandパネルは専用ウェブサイトでデザイン DesignStudio: https://designstudio.illumina.com/ Assay Technology Design Name 14 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 15: On-Demandパネルは専用ウェブサイトでデザイン
On-Demandパネルは専用ウェブサイトでデザイン ①遺伝子名を入力、 もしくはアップロード 実験で得られたカバレッ ジ、Ampliconの位置、読 むことができなかった領 域(Gaps)をビューワーで ②それぞれの標的遺 確認することが可能です。 伝子の カバレッジと その均一性を確認す ることが可能 15 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 16: On-Demandパネルは検証結果を確認可能
On-Demandパネルは検証結果を確認可能 16 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 17: On-Demandパネル製品構成
On-Demandパネル製品構成 製品構成 カタログ 20023977 20023979 20023983 20023980 20023978 20023981 番号 遺伝子数 1-50 1-50 51-300 51-300 301-500 301-500 サイズ 24反応 96反応 24反応 96反応 24反応 96反応 価格（円） 180,000 720,000 240,000 960,000 320,000 1,280,000 サンプルあ たりの価格 7,500 7,500 10,000 10,000 13,334 13,334 （円） 17 For Research Use Only.
Slide 18: AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2遺伝子一覧
AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2遺伝子一覧 体細胞突然変異カタログ（COSMIC）データベースにおいてがんとの関連が特定された 50の遺伝子のホットスポット領域にわたり体細胞変異を調べる ABL1 EGFR GNAS KRAS PTPN11 AKT1 ERBB2 GNAQ MET RB1 ALK ERBB4 HNF1A MLH1 RET APC EZH2 HRAS MPL SMAD4 ATM FBXW7 IDH1 NOTCH1 SMARCB1 BRAF FGFR1 JAK2 NPM1 SMO CDH1 FGFR2 JAK3 NRAS SRC CDKN2A FGF
Slide 19: コスト試算例： Cancer HotSpot v2
コスト試算例： Cancer HotSpot v2 希望販売 24サンプル実 サンプルあた カタログ番号 製品名 価格 施に必要な りの価格 （円） キット数 （円） AmpliSeq Cancer Hotspot Panel 200191161 78,000 1 3,250 v2 for Illumina AmpliSeq Library PLUS for 20019101 372,000 1 15,500 Illumina (24 Reactions) AmpliSeq CD Indexes Set A for 20019105 80,700 1 841 Illumina (96 Inde
Slide 20: コスト試算例： On-Demandパネル
コスト試算例： On-Demandパネル (50遺伝子までの場合) 希望販売 24サンプル実 サンプルあた カタログ番号 製品名 価格 施に必要な りの価格 （円） キット数 （円） AmpliSeq Cancer Hotspot Panel 200191161 180,000 1 7,500 v2 for Illumina AmpliSeq Library PLUS for 20019101 372,000 1 15,500 Illumina (24 Reactions) AmpliSeq CD Indexes Set A for 20019105 80,700 1 841 Illumina
Slide 21: AmpliSeq for illumina イルミナウェビナーのご紹介
AmpliSeq for illumina イルミナウェビナーのご紹介 ● イルミナで AmpliSeq for Illumina パネル解析をはじめよう -製品紹 介とライブラリー調製編-【イルミナiSchool 初級】 - https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-180425-j.html ● イルミナで AmpliSeq for Illumina パネル解析をはじめよう -情報解 析編-【イルミナiSchool 初級】 - https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar
Slide 22: AmpliSeq for illuminaの試薬価格
AmpliSeq for illuminaの試薬価格 AmpliSeq for Illumina ライブラリー調製用試薬 サンプルあたりの 希望販売価格 カタログ番号 製品名 価格（円） （円） 20019101 AmpliSeq Library PLUS for Illumina（24 Reactions） 15,500 372,000 20019102 AmpliSeq Library PLUS for Illumina（96 Reactions） 12,813 1,230,000 20019103 AmpliSeq Library PLUS for Illumina（384 Reacti
Slide 23: Nextera Flex for Enrichmentの紹介
キャプチャー法 Nextera Flex for Enrichmentの紹介 1. ワークフロー 2. パネルの種類 3. コスト 23 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 24: 標的配列を読むためのライブラリー調製手法「キャプチャー法」
標的配列を読むためのライブラリー調製手法 「キャプチャー法」 アンプリコン法 キャプチャー法 サンプル ↓ サンプル ショットガンライブラリ ↓ ↓ マルチプレックスPCR プローブによる ハイブリ・キャプチャー AmpliSeq for illumina Nextera Flex for Enrichment 24 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 25: Nextera DNA Flex for Enrichmentに必要なサンプル量など
Nextera DNA Flex for Enrichmentに必要な サンプル量など ⚫ インプット：高品質のDNA、FFPE由来のDNA、血液、唾液 ⚫ 必要インプット量 DNA：1～1000 ng FFPE由来DNA： 50～1,000 ng、∆ Cq ≤ 5 血液： 10 µl の全血* 唾液： 30 µl* *血液と唾液サンプルからのDNA抽出には、別途購入品が必要 ⚫ 作業時間：6.5時間（ハンズオン2時間） まずはショットガンライブラリーを調製し、問題 がないことを確認してから、濃縮に進むと良い ⚫ イルミナでシーケンサー内蔵の解析ソフトウェアやクラウド環境で の専用の解析ツール
Slide 26: Nextera Flex for Enrichmentのワークフロー
Nextera Flex for Enrichmentのワークフロー Step 1: ショットガンライブラリーの作製 Step 2: プール Step 3: 濃縮 1–1,000 ng ＤＮＡインプット 10 μl 血液、30 μl唾液からも可能 合計6.5 時間1 ハンズオン2時間 1. 合計時間は、アッセイのみの時間 DNA/RNA 定量、希釈およびライブラリーの定量、希釈時間は含まない 26 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 27: Step 1: ショットガンライブラリーの作製
Nextera Flex for Enrichmentのワークフロー Step 1: ショットガンライブラリーの作製 ビーズ結合トランスポソームがDNAと飽和すると、それ以上タグメンテーションが起こることはあ りません。このため、飽和による安定したノーマライゼーションが可能となります。 DNA Enrichment Bead-Linked 1. スタート量が Transposome (eBLT) DNA-eBLT complex 50~1,000ng であれば、 Tagment with eBLT スタート量をそろえる 必要性がない。 Tagmented Library 2. ショットガンライ
Slide 28: Step 2: プール（マルチプレックスの場合）
Nextera Flex for Enrichmentのワークフロー Step 2: プール（マルチプレックスの場合） シングルプレックス、もしくは12プレックスでの濃縮反応を推奨。 12プレックスの場合、濃縮コストを大幅に抑えることができます。 Indexed Library Pooled Sample Library 【濃縮前のライブラリーのプーリング】 DNAインプットが50 ng以上の場合は、 DNA質量濃度の測定は不要に！ ショットガンライブラリーの収量がほぼ一定となり、濃縮前のプール（ライブラ リー混合）は、体積等量でまぜればOK! 28 For Research Use Only
Slide 29: Step 3: 濃縮
Nextera Flex for Enrichmentのワークフロー Step 3: 濃縮 Pooled Sample Library Add biotinylated probe panel Panel (標的領域を キャプチャーする Enrich using streptavidin magnetic beads プローブ) Elute enriched library from beads Enriched Library PCR amplify Sequencing-ready library 29 For Research Use Only. Not for use in diagn
Slide 30: Nextera Flex for Enrichmentで購入いただく試薬
Nextera Flex for Enrichmentで購入いただく試薬 ライブラリ調製・濃縮試薬、インデックス、パネル ライブラリ調製・ 濃縮試薬 ＋ インデックス ＋ パネル (プローブ) 2種類をご用意 Nextera compatible unique 以下より選択： • 16サンプル dual indices Set A • イルミナカタログパネル （1プレックス、16濃縮反応） (96インデックス, • イルミナカスタムパネル 96サンプル) • 3rd party カタログパネル • 96サンプル • 3rd partyカスタムパネル （12プレックス、8濃縮反応） サンプルによ
Slide 31: イルミナカタログパネル概要
イルミナカタログパネル概要 パネル名 サイズ 標的領域 Illumina Exome ヒト全遺伝子のコーディングエクソン領域 8濃縮 (CEX) （45 Mb） TruSight One 6濃縮 ヒト疾患に関連する4,813遺伝子 TruSight One 6濃縮 ヒト疾患に関連する6,704遺伝子 Expanded TruSight Cancer 8濃縮 がん素因に関連する94遺伝子と284のSNP TruSight Hereditary 小児期に発症する重度劣性疾患に関連する 8濃縮 Cancer 552遺伝子 遺伝性心臓疾患（ICC）への関与が知られて TruSightCardio 8濃
Slide 32: Nextera Flex for Enrichmentで使用可能なパネル
Nextera Flex for Enrichmentで使用可能なパネル カタログパネル カスタムパネル 3rd party パネル 7 合成済 受注生産 他社製のカタログパネル、 カスタムパネル デザイン済みのパネル お客様がデザインする製品 Illumina Exome (CEX) 研究目的に応じて、標的遺伝 ＜条件＞ 子・標的領域を自由に設計 -ビオチン化プローブ TruSight One TruSight One Expanded プローブ数： -プローブ長： 2,000 ～ 675,000 80 bp または 120 bp TruSight Cancer (15 Mb程度まで) -プ
Slide 33: コスト試算例： Illumina Exome
コスト試算例： Illumina Exome 1-plexで濃縮反応を行った場合 希望販売価格 サンプルあたり カタログ番号 製品名 （円） の価格（円） 20020183 Illumina Exome Panel (8 enrichments) 301,000 37,625 Nextera DNA Flex Pre-Enrichment Library 20025523 Prep and Enrichment Reagents - 16 616,000 38,500 samples (16, 1-plex enrichment reactions) Nextera Compatible Un
Slide 34: Nextera DNA Flex for Enrichmentの試薬価格
Nextera DNA Flex for Enrichmentの試薬価格 ショットガンライブラリー調製と濃縮の際に使用する試薬のセット (濃縮用プローブは別で準備が必要) 1反応あたりの 製品番号 製品名 反応数 価格（円） コスト(円)*3 Nextera DNA Flex Pre-Enrichment Library Prep and Enrichment Reagents - 16 20025523 16 616,000 38,500 samples (16, 1-plex enrichment reactions)*1 Nextera DNA Flex Pre-Enrichment L
Slide 35: Nextera DNA Flex for Enrichment用のプローブ
Nextera DNA Flex for Enrichment用のプローブ 【イルミナのプローブ】 1サンプルあたり カタログ番号 製品名 価格（円） のコスト（円）* 20020183 Illumina Exome Panel (8 enrichments) 301,000 3,135 20029226 TruSight One Expanded (6 enrichments) 189,000 2,625 20029227 TruSight One (6 enrichments) 189,000 2,625 FC-121-0202 TruSight Cancer (8 enrichments
Slide 36: シーケンスデザインを考える
NAIR OY—T YATES VEBRS 36 illumina’
Slide 37: シーケンスデザインを考えるための二つのファクター
シーケンスデザインを考えるための二つの ファクター 変異・バリアントの頻度によって変わる。頻度が低い場合には、 たくさん読まないと検出できません。 – 生殖細胞系列のバリアント（ヘテロバリアントの割合は50%）の 検出にはカバレッジX20以上シーケンスが必要。 – がんといった体細胞変異の場合、頻度5%の変異の検出にはカバ レッジX500以上が必要。 – 上記は、SNP・Short Indelの検出に対し、一般的に言われているこ ととなります、目的によってさまざまです。 必ずしも標的領域だけ均一に読めるわけではない。 – アンプリコン系であればPCR、キャプチャ系であればハイブリダ イゼーショ
Slide 38: カバレッジ・均一性・オンターゲット率について
シーケンスデザインを考える カバレッジ・均一性・オンターゲット率について カバレッジ カバレッジの均一性 カバレッジ： 標的領域を何回シーケンスしたか？ 均一性: 標的領域のカバレッジの凸凹 オンターゲット率: シーケンスデータのうち標的領域が読まれた割合 38 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 39: アンプリコン法では標的領域を何リード読んだか？
アンプリコン法では標的領域を何リード読んだか？ アンプリコン法 【考え方】 標的領域をリード何本で読んだか？ 生殖細胞系列: カバレッジX250程度(250本程 度)まで。 体細胞変異(5%頻度):カバレッジX2,500程度 (2,500本程度)まで。 アンプリコン数が100のパネルで、体細胞変異（5%頻度)の検出を目的とした場合、 100 X 2,500 = 250,000、検体当たり25万本読む必要がある。 ↓ iSeq 100 では一回のシーケンスで400万クラスター解析ができるので、 400万 ÷ 25万 = 16、1回のシーケンスで16検体の解析が可能となる。 39 For Rese
Slide 40: キャプチャ法では標的領域の何倍を読んだか？
キャプチャ法では標的領域の何倍を読んだか？ キャプチャ法 【考え方】 標的領域の何倍を読むのか。 生殖細胞系列: 標的領域の100~200倍程度* 体細胞変異:標的領域の300~1,000倍程度* *読み量は製品性能や目的に大きく依存しま す。 標的領域が1.2 Mbのパネルで、生殖細胞系列のバリアントの検出を目的とした場合、 1.2 Mb X 100~200 = 120~240 Mb、検体当たり120~240 Mbが必要。 ↓ iSeq 100 では一回のシーケンスで1.2 Gbの収量となるので、 1.2 Gb ÷ 120~240 Mb = 5~10、1回のシーケンスで5~10検体の解析が可
Slide 41: 解析結果で期待した解析ができたかが確認可能
解析結果で期待した解析ができたかが確認可能 アンプリコン法 各アンプリコンの標的領域のカバレッジが確認できます。 キャプチャ法 標的領域のカバレッジのヒストグラムや集計結果を確認できます。 41 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 42: 情報解析はイルミナで専用ツールを準備しています
情報解析はイルミナで専用ツールを準備しています ① シーケンス ローカル環境 クラウド環境 ② 変異・バリアントコー ル シーケンスデータを参照 配列にアライメントを行 い、変異・バリアントを Local Run Manager™ 見つける。 ③ アノテーション 変異・バリアントにデー タベースを参考に注釈を つけ、生物学的に重要な ものを同定する。 42 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 43: まとめ
まとめ ⚫ AmpliSeq for Illumina （アンプリコン法）： 比較的狭い領域の解析に適しており、前処理が簡便で必要サンプル量が少な い。 ⚫ Nextera flex for Enrichmet（キャプチャー法）： 比較的広い領域の解析に適しており、幅広いイサンプル量に対応可能。50 ng 以上のDNAや、血液、唾液サンプルからスタートする場合、ノーマライゼー ションが不要に。 ⚫ どちらも、FFPEサンプルに対応していて、研究目的に合わせて、カタログパ ネル、カスタムパネル等を選択することができる。 ⚫ AmpliSeq for Illumina On-Demandといった検
Slide 44: ご清聴ありがとうございました
ご清聴ありがとうございました 44 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 45: Appendix:パネルの選択
Appendex:パネルの選択 45 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.