Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (November 2018)
38 slides from Illumina's technical presentation, Nov 28, 2018
Slide 1: NGSをはじめよう ～イルミナシーケンサーの基礎～
NGSをはじめよう ～イルミナシーケンサーの基礎～ 富田 みなみ イルミナ株式会社 テクニカルアプリケーションサイエンティスト November 28, 2018 © 2017 Illumina, Inc. All rights reserved.
Slide 2: 本日の Outline
本日の Outline イルミナシーケンサーのラインナップ 知っておきたいイルミナシーケンサーのワークフローと原理 研究目的に合った装置の選び方 2 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 3: 本日の Outline
本日の Outline イルミナシーケンサーのラインナップ 知っておきたいイルミナシーケンサーのワークフローと原理 研究目的に合った装置の選び方 3 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 4: イルミナシーケンサーのラインナップ
イルミナシーケンサーのラインナップ iSeq MiniSeq MiSeq NextSeq NovaSeq 100 550 6000 1ランあたりの 最大データ収量 1.2 7.5 15 120 6,000 (G bases) パスフィルター リード数 4M 25 M 25 M 400 M 1.6-20 B 最大リード長 (base pair) 2x150 2x150 2x300 2x150 2x150 データ収量(G base) 4 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 5: 本日の Outline
本日の Outline イルミナシーケンサーのラインナップ 知っておきたいイルミナシーケンサーのワークフローと原理 研究目的に合った装置の選び方 5 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 6: イルミナシーケンサーのワークフロー
イルミナシーケンサーのワークフロー ライブラリー調製 （前処理） クラスター形成 ライブラリーを増幅する シーケンス 塩基配列（蛍光）を読み取る データ解析 6 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 7: イルミナシーケンサーのワークフロー
イルミナシーケンサーのワークフロー ライブラリー調製 （前処理） クラスター形成 ライブラリーを増幅する シーケンス 塩基配列（蛍光）を読み取る データ解析 7 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 8: DNAライブラリーの調製方法
1.ライブラリー調製： イルミナシーケンサーで解析するための前処理 DNAライブラリーの調製方法 ゲノムDNA DNAの断片化 2種類のアダプター付加 数百bp →DNAライブラリー 8 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 9: イルミナシーケンサー解析用DNAライブラリーの構造
1.ライブラリー調製： イルミナシーケンサーで解析するための前処理 イルミナシーケンサー解析用DNAライブラリーの構造 P5 In2 Rd1 SP DNA insert Rd2 SP In1 P7 5’ 5’ イルミナシーケンサー専用オリゴヌクレオチドアダプター ▪ DNA Insert 数百bpに断片化したDNA（解析する配列） ▪ P5, P7 フローセルへの結合部位→DNA増幅 ▪ Index (In1, In2) 複数サンプル解析用のバーコード ▪ SP (Rd1, Rd2, SP) シーケンスプライマー結合部位→シーケンス 9 For Research Use Only. Not f
Slide 10: Indexの役割とは？
1.ライブラリー調製： イルミナシーケンサーで解析するための前処理 Indexの役割とは？ DNAライブラリーの端に、識別のためのインデックスが付加されてある →それぞれのDNA断片がどのサンプル由来か同定が可能・簡単 →サンプルを混ぜて（pooling)解析して、後でクラスターをそれぞれのサンプルに 振り分けることが可能（de-multiplex） →多サンプル解析(multiplex analysis)が可能 P5 In2 Rd1 SP DNA insert Rd2 SP In1 P7 5’ 5’ 10 For Research Use Only. Not for use in diagn
Slide 11: マルチプレックス法
1.ライブラリー調製： イルミナシーケンサーで解析するための前処理 マルチプレックス法 異なる配列のインデックスを利用することで、1回のランで多サンプル を同時にシーケンスできる サンプルをまとめる シーケンス 異なるindex目印を付けて、 解析の際、Indexによって ライブラリー調製を行う 各サンプルを区別する 例）MiSeqフローセルの場合 1レーンに複数サンプル混ぜることができる 11 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 12: ライブラリー定量と品質の確認
1.ライブラリー調製： イルミナシーケンサーで解析するための前処理 ライブラリー定量と品質の確認 ライブラリーの調製 推奨定量方法 (＊キットごとに最適な方法は異なる) qPCR Qubit Picogreen など 定量、定性 推奨定性方法 (＊キットごとに最適な方法は異なる) Bioanalyzer ゲル電気泳動 など ライブラリーの投入 正確なライブラリー品質の確認と定量が、最適なクラス ター密度と高いシーケンスパフォーマンスを得るために は必要不可欠である。 クラスター形成へ 12 For Research Use Only. Not for use in diagnostic pro
Slide 13: イルミナシーケンサーのワークフロー
イルミナシーケンサーのワークフロー ライブラリー調製 （前処理） クラスター形成 ライブラリーを増幅する シーケンス 塩基配列（蛍光）を読み取る データ解析 13 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 14: クラスター形成：ライブラリーを増幅する
2. クラスター形成： ライブラリーを増幅する • クラスター形成は、調製したDNAライブラリーを シーケンスの際に検出可能な充分量に増やす目的で行う増幅工程 フローセルへの クラスターの 結合 合成 イルミナ ライブラリー フローセル 例）MiSeq 14 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 15: クラスター形成はフローセル上で行われる
2. クラスター形成： ライブラリーを増幅する クラスター形成はフローセル上で行われる 例）MiSeqフローセルの場合 フローセル上のオリゴヌクレオチドを認識 各レーンにライブラリーのアダプターを 認識するオリゴヌクレオチドが結合して いる 15 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 16: フローセルは装置によって異なる
2. クラスター形成： ライブラリーを増幅する フローセルは装置によって異なる iSeq MiniSeq MiSeq NextSeq NovaSeq 100 550 6000 1.2 Gb | 4M 7.5 Gb | 25M 15 Gb | 25M 120 Gb | 400M 167 – 6000 Gb | 1.6 – 20B 2x150 2x150 2x300 2x150 2x150 データ収量(G base) 16 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 17: 従来のフローセルにおけるクラスター形成
2. クラスター形成 従来のフローセルにおけるクラスター形成 17 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 18: ブリッジ増幅によるクラスター形成
2. クラスター形成 ブリッジ増幅によるクラスター形成 変性 ① ② ③ ④ フローセル ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ 例）MiSeqの場合 MiSeq用フローセル当り、 最大2,500万のクラスターが形成される 18 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 19: イルミナシーケンサーのワークフロー
イルミナシーケンサーのワークフロー ライブラリー調製 （前処理） クラスター形成 ライブラリーを増幅する シーケンス 塩基配列（蛍光）を読み取る データ解析 19 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 20: Sequencing By Synthesis (SBS) 法
3. シーケンス 3. シーケンシング： 塩基配列（蛍光）を読み取る Sequencing By Synthesis (SBS) 法 可逆的ターミネーターを用いて一塩基ずつシーケンスする 3’末端に保護基があるためDNA合成が一塩基ずつストップしながら行われる 1反応に蛍光ラベルされた 4ヌクレオチドを加える（蛍光の種類で塩基を特定） 蛍光色素 O O HN HN X 切断部位 O N O N 次のサイクルへ 5’ (3’) 5’ PPP O P O ①取り込み 3’ 3’ ②保護基を除去 OH 保護基 ③蛍光色素を除去 20 For Research Use Only. Not for us
Slide 21: 1サイクルの蛍光シグナル取得イメージ
3. シーケンス 3. シーケンシング： 塩基配列（蛍光）を読み取る 1サイクルの蛍光シグナル取得イメージ 蛍光シグナルから塩基情報への置換 (A) ① ② ③ ④ ⑤ G T T T C A 次のサイクルへ… (B) 21 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 22: ペアエンドシーケンス & シングルインデックス
3. シーケンス 3. シーケンシング： 塩基配列（蛍光）を読み取る ペアエンドシーケンス & シングルインデックスでシーケンスする場合 クラスター形成 ターン アラウンド ① ③ ② 変性 & インデックスプ ライマーのハイブリ 22 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 23: シーケンサーテクノロジーの紹介
2. クラスター形成 シーケンサーテクノロジーの紹介 3. シーケンス フローセル • ランダムフローセルからパターンフローセルへ SBSケミストリー • 4色法から2, 1色法へ C T Image2 G A Image1 23 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 24: ランダムフローセルとパターンフローセル
2. クラスター形成 ランダムフローセルと 3. シーケンス パターンフローセル ランダムフローセル パターンフローセル • HiSeq 2500, MiSeq, NextSeq, MiniSeq • HiSeq 3K/4K/X, NovaSeq, iSeq 100 • クラスター間の距離がランダム • クラスター間の距離が一定 • クラスター形成が高速化 • イメージングの効率化 NextSeq550 NovaSeq6000 MiSeq HiSeq X MiniSeq iSeq100 24 For Research Use Only. Not for use in diagnostic pr
Slide 25: パターンフローセルにおけるExAmpクラスター形成
2. クラスター形成 パターンフローセルにおける ExAmp クラスター形成 25 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 26: ExAmpクラスター形成工程
2. クラスター形成 ExAmpクラスター形成工程 各ナノウェルに１つのクラスターだけを形成 ① ② Wells contain grafted oligos Libraries hybridize and bridge 変性 ③ ④ Multiple cycles of amplification Ready for Sequencing 26 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 27: SBSケミストリー 4色法と2, 1色法
SBSケミストリー 3. シーケンス 4色法と2, 1色法 2色法ケミストリー 2つの色素を混合し、2つのイ 4色法ケミストリー メージ取得することで4つの塩基 を決定。 緑のイメージのみで観察されるクラスター: T 赤のイメージのみで観察されるクラスター: C 赤と緑のイメージ両方で観察されるクラス ター: A 標識されていないクラスター: G 1色法ケミストリー 1色で識別可能。 色素の除去、添加を行う2回のケミ ストリーステップ、2回のイメージ C 取得で4つの塩基を決定。 Image2のIntensity 4塩基それぞれが異なる色素を持 T Aの色素を除去、Tに色素を添加 ち、塩基を4
Slide 28: SBSケミストリー 4色法と2, 1色法
3. シーケンス SBSケミストリー 4色法と2, 1色法 MiSeq NextSeq 550 iSeq 100 HiSeq MiniSeq NovaSeq 6000 ・蛍光の映り込み（クロストーク）がない ・イメージング時間の高速化 28 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 29: イルミナシーケンサーラインナップまとめ
イルミナシーケンサーラインナップまとめ 収量 ラン時間 Flow Cell 検出法 (150 x 2 cycleの場合) (150 x 2 cycleの場合) Rapid v2 Rapid v2 HiSeq ランダム 4色法 デュアルフローセル： デュアルフローセル： 150~180 Gb 40時間 V2 Nano V2 Micro V2 V2 Nano V2 Micro V2 MiSeq ランダム 4色法 300Mb 1.2Gb 4.5~5.1Gb ~17時間 ～19時間 ~24時間 中出力 高出力 中出力 高出力 NextSeq ランダム 2色法 32.5~39 Gb 100~120 Gb
Slide 30: イルミナシーケンサーのワークフロー
イルミナシーケンサーのワークフロー ライブラリー調製 （前処理） クラスター形成 ライブラリーを増幅する シーケンス 塩基配列（蛍光）を読み取る データ解析 30 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 31: データ解析
4. データ解析： イメージデータから得た塩基配列で解析を行う 一次解析 二次解析 データの可視化 画像から塩基配列に変換 アライメント、変異・バリア ントの検出など 対応ソフトウェア 対応ソフトウェア 対応ソフトウェア • Instrument Control Software • BaseSpace Sequence Hub • Illumina standalone options • Real-Time Analysis (RTA) • On Instrument Analysis • BaseSpace Sequence Hub • Third-party software • Th
Slide 32: 本日の Outline
本日の Outline イルミナシーケンサーのラインナップ 知っておきたいイルミナシーケンサーのワークフローと原理 研究目的に合った装置の選び方 32 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 33: データ量に応じた装置の選択が重要
データ量に応じた装置の選択が重要 シーケンスリードを参照配列にマッピングした際、任意の配列上にアラインされた シーケンスリードの数を“カバレッジ”として定義する。 データ量、カバレッジ（デプス）の考え方 カバレッジ(デプス): 標的領域をどれぐらい の回数で読めたか？ 平均カバレッジ = ランで得られるデータ収量 ゲノムサイズ or ターゲットサイズ アプリケーションだけでなく、リファレンスゲノムサイズ、遺伝子発現レベル、 公表文献、科学界が規定するベストプラクティスといったさまざまな要因に基づ いて、必要なカバレッジを判断する。 33 For Research Use Only. Not f
Slide 34: データ量に応じた装置の選択が重要
データ量に応じた装置の選択が重要 シーケンスリードを参照配列にマッピングした際、任意の配列上にアラインされた シーケンスリードの数を“カバレッジ”として定義する。 データ量、カバレッジ（デプス）の考え方 カバレッジ(デプス): 標的領域をどれぐらい の回数で読めたか？ 平均カバレッジ = ランで得られるデータ収量 ゲノムサイズ or ターゲットサイズ 例）ヒト全ゲノムのリシーケンスの場合 ゲノムサイズ：3 Gb 、 平均カバレッジ：一般的に “x30” 必要とされている 3 Gb x 30 = 90 Gb →約100 Gbの データ収量 が必要 34 For Research Use Only
Slide 35: 研究目的に合った装置の選び方
研究目的に合った装置の選び方 iSeq MiniSeq MiSeq NextSeq NovaSeq 100 550 6000 1ランあたりの 最大データ収量 1.2 7.5 15 120 6,000 (Gbases) 数十遺伝子パネル 数百遺伝子パネル おおよその用途 エクソーム 全ゲノム がんの体細胞変異の検出には高いカバレッジが要求され、ターゲットとする遺伝子領域に応 じて装置を選択する。 エクソーム解析、ヒトゲノムの遺伝子型決定にはNextSeq、NovaSeqなどハイスループット な装置が使用可能。 35 For Research Use Only. Not for use in di
Slide 36: 例）がんパネル
例）がんパネル 各パネル推奨カバレッジに基づく１ランあたりのサンプル数 標的 MiniSeq MiSeq NextSeq パネル製品 iSeq 遺伝子数 中出力 高出力 v2 v3 中出力 高出力 AmpliSeq for 50 Illumina Cancer 16 32 96 60 96 - - Hotspot v2 遺伝子 AmpliSeq for 52 8 16 48 30 48 - - Illumina Focus 遺伝子 AmpliSeq for Illumina 161 - - 3 - 3 16 48 Comprehensive 遺伝子 v3 AmpliSeq for Illumi
Slide 37: 例）ヒト全ゲノムのリシーケンス
例）ヒト全ゲノムのリシーケンス 推奨カバレッジ(x30)に基づく１ランあたりのサンプル数 ヒトゲノム(3 Gb)の全ゲノムリシーケンス 一般的に、遺伝子型の決定には100 Gb必要とされている MiSeq NextSeq HiSeq2500 NovaSeq HiSeq HiSeq Rapid 高出力 4000 X v3 中出力 高出力 S1 S2 S4 v2 v4 ~15 ~39 ~120 100~ 0.9~ 1.3~ 1.6~ 0.8~ 2~ 4.8~6 出力 Gb Gb Gb 120 Gb 1.2 Tb 1.5 Tb 1.8 Tb 1 Tb 2.5 Tb Tb リード長 - - 2x150
Slide 38: まとめ
まとめ 知っておきたいイルミナシーケンサーのワークフローと原理 ①ライブラリーの調製 アダプター配列の連結、複数検体解析のためのindex付加 ②ブリッジ増幅によるクラスター形成 ③シーケンス SBSケミストリーの原理 ④データ解析 最近のイルミナテクノロジーの紹介（クラスター形成、シーケンス） - ExAmpによるクラスター形成 - 2, 1色法のテクノロジー 研究目的に合った装置の選び方 - 研究目的によって、サンプルあたりに必要なデータ量が異なる。それに合わせた 装置を選択することが重要。 38 For Research Use Only. Not for use in diagnost