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Illumina — Technical Presentation (March 2020)
45 slides from Illumina's technical presentation, Mar 25, 2020
Slide 1: NGS解析をはじめよう ～基礎からわかるバイオインフォマティクス入門編～
NGS解析をはじめよう ～基礎からわかるバイオインフォマティクス入門編～ 仁田原 翔太 テクニカルアプリケーションサイエンティスト March 25, 2020 © 2019 Illumina, Inc. All rights reserved. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 2: 本日の内容
本日の内容 ● シーケンスをどのように計画するか - リード長、データ量の設定について ● １次解析 FASTQ生成 ● 2次解析のワークフロー、アウトプットファイル - 読んだ配列をつなげる - 読んだ配列の数を数える - 読んだ配列と元の配列との違いを見つける 2
Slide 3: シーケンスをどのように計画するか
シーケンスをどのように計画するか 3 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 4: 解析目的
解析目的 シーケンス：全ゲノムシーケンス(WGS) 新しくゲノムを決めて、 データ解析：アセンブル、遺伝子予測 どんな遺伝子があるか知りたい 結果ファイル：ゲノム配列, 遺伝子配列（fasta） シーケンス：WGS, ターゲットシーケンス ゲノムを比較して違い(SNP等) データ解析：マッピング、変異解析 を見つけたい 結果ファイル：アライメント(bam), 変異結果(vcf) シーケンス： RNA-Seq, mRNA / Total RNA 発現量の解析をしたい データ解析：マッピング、発現頻度解析 融合遺伝子の解析をしたい 結果ファイル：アライメント(bam), 発現頻度テーブル 解析目的
Slide 5: リードのタイプ、リード長、データ量の設定
リードのタイプ、リード長、データ量の設定 5 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 6: リードのタイプ、リード長はどのように設定するか？
リードのタイプ、リード長はどのように設定するか？ ライブラリーのインサート ライブラリーのインサート ● ペアエンドかシングルエンドか - ChIP-Seq, 発現頻度解析ではシングルエンドでコストなどを削減で きる - ペアエンドではリード間の距離の情報を使えるため、アライメント をより正確に行える - 新規スプライスバリアント、構造変異、融合遺伝子検出に有利 ● リード長はどのくらいに設定するか - Small RNAなど読む対象が短い場合は長くしても情報は増えない - アセンブルや構造変異などでは情報が増えるので、長くすると一般 に有利 6 For Research Use Only.
Slide 7: どのくらいのシーケンスを読めばよいか？
どのくらいのシーケンスを読めばよいか？ アプリケーションによって必要なシーケンス量は異なる どのように考えたらよいか？-> カバレッジ ✓ カバレッジ: 配列を何回読むか、何度も読むことで正確性を担保する アプリケーション 一般的なカバレッジの目安 生殖細胞の変異解析 x30 体細胞の変異解析 x200 ~ (allele頻度による） De novoアセンブル x100 RNA-Seq 500-6000万リード (解析目的による) 解析目的によっても変わるので論文などをご確認頂くことをお奨め致します。 Considerations for RNA-Seq read length and cov
Slide 8: 1次解析 FASTQ生成
1次解析 FASTQ生成 8 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 9: シーケンサー内の１次解析
シーケンサー内の１次解析 … 装置内でランと同時に実行 Instrument Control Software CGAT Real-Time Analysis CYCLE 1 CYCLE 2 CYCLE 3 BCL File BCL File BCL File ラン終了後に実行 BCLファイルから FASTQファイルへの変換 サンプルごとのFASTQ 各サイクルごとに取得した ImageからIntensityを取得し、 Base Call を行なう。それをもとにFASTQファイルへ変換する 9 For Research Use Only. Not for use in diagnostic p
Slide 10: FASTQファイルとは
FASTQファイルとは ✓ FASTQファイル：４行で１つの配列を表すテキストファイル @SIM:1:FCX:1:15:6329:1045 1:N:0:2 TCGCACTCAACGCCCTGCATATGACAAGACAGAATC + <>;##=><9=AAAAAAAAAA9#:<#<;<<<????#= １行目: 配列ID, シーケンサーやクラスターの位置情報を含む ２行目: 得られた配列 ３行目: 区切りを示すためのサイン ４行目: 得られた配列のクオリティスコア（Phred +33, ASCII） 配列が並んでいるだけなので２次解析で意味付けをする必要がある FASTQ Files ht
Slide 11: BCLからFASTQへの変換
BCLからFASTQへの変換 FASTQファイルの変換は３つの方法がある BaseSpace: クラウドベースの解析プラットフォーム ランデータを装置からアップロード、自動でFASTQ生成可能。 環境構築不要、クリックでお手軽に解析を実施可能 Local Run Manager: 装置内蔵のツール。ランセットアップ、解析も可能。 装置内でラン後自動でFASTQ生成と２次解析を実施可能 ご自身のPCにもインストール可能、クリックで解析を実施可能 bcl2fastq: サーバーにインストールし、FASTQ生成を行なう ラン後に実施頂く必要がある。２次解析は含まれない。 お客様で環境構築、コマンドを
Slide 12: BaseSpace Sequence Hubを用いた解析
BaseSpace Sequence Hubを用いた解析 https://basespace.illumina.com/home/index から登録して使用可能です。 30日間、250 icreditの試用期間が付与されます。 試用期間終了後は有償のプロフェッショナルライセンスに登録いただく必要があります。 またイルミナより提供しているPublic Dataもございます。 12 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 13: ２次解析のワークフロー、アウトプットファイル
２次解析のワークフロー、アウトプットファイル 13 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 14: ２次解析のワークフロー
２次解析のワークフロー つなげる 数える 違いをみつける 解析をどのように行うかというのは大きく分けて３つ 1. 読んだ配列をつなげる 2. 読んだ配列の数を数える 3. 読んだ配列と元の配列との違いを見つける 14 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 15: 1. 読んだ配列をつなげる
1. 読んだ配列をつなげる 15 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 16: 読んだ配列をつなげる: アセンブル
読んだ配列をつなげる: アセンブル リードが共通する部分でアセンブリを行ないContigを作成し、 ペアエンドシーケンスの位置情報を利用し、Contig同士をつなげ、 Scaffoldを作成、ドラフトゲノムを再構成する ✓ Contig : ゲノムを再構成した配列 ✓ Scaffold : Contig同士をNでつないだ配列 The present and future of de novo whole-genome assembly doi: 10.1093/bib/bbw096 16 For Research Use Only. Not for use in diagnostic proc
Slide 17: BaseSpace Sequence Hub: アセンブルアプリ
BaseSpace Sequence Hub: アセンブルアプリ • Nextera Mate Pairで調整したバクテリアのライブラリー用にデザインされたアプリ • データ量は100X 以下にする • トリミングしないデータを使用することを推奨 • アウトプットのデータとしては、アセンブリした配列 (Contig, Scaffold)、統計情報 • 3rd Partyツールのバクテリアゲノム用アプリ • 大きなゲノムサイズの生物は対象外 • ペアエンド、シングルエンド、メイトペアのデータを扱うことができる • アウトプットのデータとしては、アセンブリした配列、統計情報 ※ 3rd Party
Slide 18: BaseSpace アセンブルアプリ: 操作方法
BaseSpace アセンブルアプリ: 操作方法 1. BaseSpace 上にProject を作成し、FASTQ File Upload 2. 解析App をLaunch する 3. Project内の解析結果を確認する Nextera Mate Pair Sample Preparation Kit と BaseSpaceで完結するバクテリアゲノムアセンブリー https://jp.illumina.com/events/webinar/archive/webinar_160426_j.html 18 For Research Use Only. Not for use in diagn
Slide 19: アセンブルアプリのアウトプットデータ
アセンブルアプリのアウトプットデータ ● アセンブリした配列データ (.faファイル) テキストファイルとなっており、開くと >[アセンブルした配列のID] ATGC… (アセンブルした塩基配列) という形式で記載されている。 ● アセンブリのサマリー情報 (.txt) アセンブルした配列の統計情報 ・Contig (Scaffold)の本数 ・Contig (Scaffold)の合計の長さ ・GC含量 (%) が確認できる。 また別のファイルではContig (Scaffold) それぞれの長さやGC含量、カバレッジなどが計算 されている。 19 For Research Use Only.
Slide 20: 読んだ配列をつなげる: アノテーション
読んだ配列をつなげる: アノテーション 1. 読んだ配列をつなげる：新しくゲノムを決めて、どんな遺伝子があるか知る 遺伝子A 遺伝子B 遺伝子C 遺伝子D アセンブリしただけではゲノムのどこが遺伝子かはわからない そこで、アノテーション付けを行ない、どんな遺伝子があるか解析する ✓ アノテーション： アセンブリしたゲノムで遺伝子領域を特定し、 どんな遺伝子かを相同性検索 (BLAST)などで決める方法 The present and future of de novo whole-genome assembly doi: 10.1093/bib/bbw096 20 For Research U
Slide 21: BaseSpace Sequence Hub: アノテーションアプリ
BaseSpace Sequence Hub: アノテーションアプリ • 原核生物ゲノムの遺伝子領域を特定し、アノテーションを付与するアプリ • ヒトゲノムなどの真核生物ゲノムには使用できない • 予測された遺伝子の配列や遺伝子名が出力される • 3rd Party製のバクテリアゲノム解析アプリ • ゲノムから種の推定、Multilocus Sequence Typing (MLST)、プラスミドの有無、 抗生物質耐性遺伝子などを解析できる ※ 3rd Partyツールのため、イルミナサポート外となります 21 For Research Use Only. Not for use in dia
Slide 22: アノテーションアプリのアウトプットデータ
アノテーションアプリのアウトプットデータ ● 予測された遺伝子の塩基配列、アミノ酸配列 (.fna/.faaファイル) 遺伝子IDとついた遺伝子名 アミノ酸配列 ● 予測された遺伝子の領域を記載したデータ (.gffファイル) ● 予測された遺伝子のサマリー情報 22 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 23: 2. 読んだ配列の数を数える
2. 読んだ配列の数を数える 23 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 24: 配列を数える: RNA-Seq マッピング、カウント
配列を数える: RNA-Seq マッピング、カウント • 得られた配列を参照配列にマッピング ✓ マッピング：得られたリードが参照配列と一致する部分を探す方法 発現量が高い マッピングされたリードの数を数えて、発現量を算出、比較することができる RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics https://doi.org/10.1038/nrg2484 24 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 25: 配列を数える: RNA-Seq マッピング、カウント
配列を数える: RNA-Seq マッピング、カウント RNA-Seqのマッピングでは、リードを分割し、Exonごとにマッピングする Exonへのマッピング状況からアイソフォームごとの発現量を算出できる 25 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 26: 配列を数える: RNA-Seq 融合遺伝子検出
配列を数える: RNA-Seq 融合遺伝子検出 ✓ 融合遺伝子: 染色体の再構成で異なる遺伝子同士がつながった遺伝子 ペアエンドのリードがそれぞれ異なる遺伝子にマッピングされたリードや ジャンクション部分にまたがってマッピングされたリードの情報を使い、 融合遺伝子の検出を行なうことができる Identification of gene fusion transcripts by transcriptome sequencing in BRCA1-mutated breast cancers and cell lines 26 https://doi.org/10.1186/1755-8794-
Slide 27: BaseSpace Sequence Hub: RNA-Seqアプリ
BaseSpace Sequence Hub: RNA-Seqアプリ • 得られたリードを参照配列にマッピング、発現量の算出、融合遺伝子の検出を 行なうアプリ • 参照配列は予め用意されたものと、自身で用意したものが使用可能 • 融合遺伝子の検出にはペアエンドリードが必要 • マッピングした結果、各遺伝子の発現量の情報、融合遺伝子の情報が出力 される • RNA-Seq Alignmentの結果をもとに、発現量の比較を行なうアプリ • 発現量が異なる遺伝子のリストだけではなく、ヒートマップや主成分分析の 結果を出力することができる。 27 For Research Use Only. Not
Slide 28: BaseSpace RNA-Seqアプリ: 操作方法
BaseSpace RNA-Seqアプリ: 操作方法 1. BaseSpace 上にProject を作成し、FASTQ File Upload 2. 解析App をLaunch する 融合遺伝子検出する場合、 リードの方向性にチェックを入れる 解析が終了してから チェックを入れる 3. Project内の解析結果を確認する RNA-Seqをはじめよう 情報解析編：初めての方でも大丈夫、クラウドを用いた簡単クリック情報解析 https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-180328-j.html 28 For Research Use
Slide 29: RNA-Seqアプリのアウトプットデータ
RNA-Seqアプリのアウトプットデータ ● 各遺伝子の発現量を記載したデータ (.sfファイル) ● アライメント結果を収録したファイル(.bamファイル) ● マッピング結果のサマリー情報 29 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 30: 発現量の補正-1:長さでの補正
発現量の補正-1:長さでの補正 RNA-Seqでは遺伝子の長さと得られた総リード数で補正を行ない正規化する 正規化して得られた値がTranscript Per Million: TPM という値 この数値を用いて発現量の比較を行なう 細胞内で同じ発現量の2つのmRNA 断片化 断片化 各遺伝子 遺伝子の長さ リード数 遺伝子1000 bpあたり のリード数 遺伝子A 600 bp 6 10 遺伝子B 200 bp 2 10 遺伝子発現量が同じでも、遺伝子が長いほど、より多くのリードが得られる そこで遺伝子 1000 bpあたりのリード数に補正を行なう 30 For Research Use O
Slide 31: 発現量の補正-2: 総リード数での補正
発現量の補正-2: 総リード数での補正 遺伝子A 遺伝子B 遺伝子C 各遺伝子のリード数 サンプル1 サンプル2 補正後 サンプル1 サンプル2 遺伝子A 10 40 遺伝子A 333333.3 333333.3 遺伝子B 5 60 遺伝子B 166666.7 500000 遺伝子C 15 20 遺伝子C 500000 166666.7 総リード数 30 120 合計 1000000 1000000 RNA-Seqでは、リード数をもとに遺伝子発現量を算出する 左表では遺伝子Aはサンプル２の方が４倍のリードがマッピングされているが、 総リード数も４倍のリードがある そこで各サンプルから100万リ
Slide 32: アライメントの確認: Integrative Genomics Viewer
アライメントの確認: Integrative Genomics Viewer bamファイルはバイナリ形式のファイルでテキストエディタなどで見ることができない。 Integrative Genomics Viewer (通称IGV)で見ることが可能になる。 Broad Instituteで作成されたツールで下記URLからフリーでダウンロード可能 http://software.broadinstitute.org/software/igv/ YouTubeでチュートリアルが公開されている https://www.youtube.com/channel/UCb5W5WqauDOwubZHb-IA
Slide 33: RNA-Seq アライメントデータの閲覧
RNA-Seq アライメントデータの閲覧 1. 参照配列を取り込む 配列名から検索も可能 2. bamファイルを取り込む インデックスファイル (.bai ファイル)を同じフォルダに 置く必要がある 3. 表示したい領域まで拡大する 表示したい染色体番号を選ぶ 表示する領域を拡大・縮小する 33 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 34: RNA-Seq アライメントデータの閲覧
RNA-Seq アライメントデータの閲覧 リファレンス配列と表示しているポジション情報 アライメントされたリード サンプル情報 遺伝子の情報、太い部分がExonを表す 34 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 35: アライメントデータの閲覧: アイソフォームごとの発現量
アライメントデータの閲覧: アイソフォームごとの発現量 心臓サンプル 肝臓サンプル Isoformが３つあり、 青色部分がExon領域 IGVでアライメントを確認することで、異なる組織間で 異なるアイソフォームが発現している様子が確認できる https://www.youtube.com/watch?v=dx9-N8b9Yj4 35 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 36: 3. 読んだ配列と元の配列との違いを見つける
3. 読んだ配列と元の配列との違いを見つける 36 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 37: 配列を数える:マッピング、変異コール
配列を数える:マッピング、変異コール • 得られた配列を参照配列にマッピング、ポジションごとに変異の有無を 確認し、出力する Whole-genome and whole-exome sequencing in neurological diseases https://doi.org/10.1038/nrneurol.2012.148 37 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 38: BaseSpace Sequence Hub:マッピング、変異コールアプリ
BaseSpace Sequence Hub:マッピング、変異コールアプリ • ターゲットシーケンスの場合、Enrichment Appを使用する • リードを参照配列にマッピング、変異コール、アノテーション付けを行なう • マッピングした結果、検出された変異の情報が出力される • 得られた変異の情報をもとにサマリー情報を算出するアプリ • 知られている変異とどのくらいマッチしているか算出、解析の正確さを評価できる 38 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 39: マッピング、変異コールアプリのアウトプットデータ
マッピング、変異コールアプリのアウトプットデータ ● アライメント結果を収録したファイル(.bamファイル) ● 検出された変異を収録したデータ (.vcfファイル) ● マッピング結果のサマリー情報 39 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 40: VariantStudio v3.0での変異フィルタリング
変異コールのフィルタリング ● 変異箇所として数万～数百万か所の変異が見つかる ● しかし、目的の変異は少数個だけ. フィルタリングをする必要がある ● VariantStudio v3.0で変異のタイプ、機能への影響、アリル頻度、 疾患などとの関連情報でフィルタリングが可能 バージョンアップしたデスクトップ版VariantStudio v3.0変異解析ソフトウェアの徹底活用法 40 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. https://jp.illumina.com/events/webinar/2017/w
Slide 41: IGVでのアライメントの確認: 偽陽性を見つける
IGVでのアライメントの確認: 偽陽性を見つける 参照配列と異なる箇所は太字のA, T, G, Cで表示されている この箇所では、参照配列AからCへの変異が検出されているが、 変異をコールしているリード(黒枠の部分)でCのベースコール が多く、クオリティスコアも低い また他のリードではCの変異が見当たらない 従って、この変異は偽陽性な変異コール(=シーケンスエラー) であると考えられる 実際にアライメントされている状況を確認することで、 コールされた変異が本当の変異なのか、 シーケンスエラーなのかを判断する助けになる Variant Review with the Integrative Ge
Slide 42: まとめ
まとめ ● 解析は大きく分けて３つあり、目的に応じて選ぶ 1) 読んだ配列をつなげる 2) 読んだ配列の数を数える 3) 読んだ配列と元の配列との違いを見つける ● イルミナのBaseSpaceを使用すれば環境構築不要、クリック のみで手軽に解析可能 42 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 43: 参考情報
参考情報 Additional Information ● Considerations for RNA-Seq read length and coverage ● FASTQ Files ウェビナー ● 進化したNextera DNA Flexを用いたライブラリー調製 ● イルミナで AmpliSeq for Illumina パネル解析をはじめよう -製品紹介とラ イブラリー調製編- ● RNA-Seqをはじめよう ライブラリー調製編：絶対に失敗しないライブラ リー調製 ● バージョンアップしたデスクトップ版VariantStudio v3.0変異解析ソフトウェ アの徹底活用法 43 F
Slide 44: 参考情報
参考情報 ウェビナー ● Nextera Mate Pair Sample Preparation Kit と BaseSpaceで完結する バクテリアゲノムアセンブリー ● RNA-Seqをはじめよう 情報解析編：初めての方でも大丈夫、クラウドを用 いた簡単クリック情報解析 ● BaseSpace Sequence Hubを使用したデータ解析の基本 Integrative Genomics Viewer ● IGV website ● IGV Youtube Channel 44 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedu
Slide 45: ご参加頂き、ありがとうございました。
ご参加頂き、ありがとうございました。 セッション終了後のご質問は techsupport@illumina.comで承ります。 45 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.