Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (April 2016)
47 slides from Illumina's technical presentation, Apr 26, 2016
Slide 1: Nextera Mate Pair Sample Prep KitとBaseSpaceで完結するバクテリアゲノムアセンブリー
Nextera Mate Pair Sample Prep KitとBaseSpaceで 完結するバクテリアゲノムアセンブリー April 26, 2016 陳 盈光(タン インコン) イルミナ株式会社 アプリケーションコンサルタント © 2015 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cBot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, ForenSeq, Genetic En
Slide 2: 本日のOutline
本日のOutline Nextera Mate Pair Sample Prep Kitの実験ワークフローと詳細 について (必要なDNAの量と性状、留意点とQCポイント、必要準備品) BaseSpaceで完結するバクテリアゲノムアセンブリーの結果紹 介 (de novoアセンブリーと遺伝子アノテーション) シーケンス De novo ライブラ リー調製 （150 bp ペ アセンブリー & アエンド） アノテーション 2
Slide 3: Mate Pair Libraryはゲノム配列の把握に重要
Mate Pair Libraryはゲノム配列の把握に重要 Mate Pair Contig Scaffold ギャップ (リピート配列) ギャップ(リピート配列)をまたぐMate Pair情報を用いれば、ゲノム上のContigの整列情報が得 られす、Scaffolfが形成可能。 より長いMate Pair情報を用いれば、より長いギャップ（リピート配列）をまたぐことが可能とな り、、より長いScaffoldが形成される。 3
Slide 4: Nextera Mate Pair Sample Prep Kitを用いてバクテリアゲノムのアセンブリー結果
Nextera Mate Pair Sample Prep Kitを用いて バクテリアゲノムのアセンブリー結果 イルミナ Application Note: De Novo Assembly of Bacteria Genomesより 4
Slide 5: Nextera Mate Pair Sample Prep Kitはバクテリアゲノムの決定に最適なツール
Nextera Mate Pair Sample Prep Kitは バクテリアゲノムの決定に最適なツール ① ② ③ ④ ⑤ 5
Slide 6: Nextera Mate Pair Sample Prep Kitで選べる二つのプロトコール
Nextera Mate Pair Sample Prep Kitで選べる二つのプロトコール ゲルフリープロトコール ゲルありプロトコール 2~ 12 kbの広いギャップサイズ 厳密なギャップサイズ DNAスタート量: 1 μg DNAスタート量: 4 μg 1キットあたり48サンプル調製が可 1キットあたり12サンプル調製が可 能 能(使用試薬量が4倍) 切り出しをしないので、ライブラリ 切り出しを行うため、操作の難易度 ー調製は簡単 が上がる 小さいゲノムのアセンブリーは最適 6
Slide 7: Nextera メイトペア実験ワークフロー
Nextera メイトペア実験ワークフロー Nextera酵素によりゲノムDNAを2から15 kb程 ① 度に断片化。DNA分子の両側にはビオチン化 ジャンクションアダプターが付加。 サイズ選択（option） DNA分子を環状化。DNA断片の両側が、ビオ ② チン化ジャンクションアダプターを介して連結。 DNA分子を再度断片化し、短いフラグメントに。 ③ ビオチンタグ(B)を介し、元のジャンクション 部分を含むサブフラグメントを回収。 ④ 末端修飾ののち、アダプターを連結し、PCR増 幅を行う。 7
Slide 8: ゲルフリーとゲルありプロトコールの違い
ゲルフリーとゲルありプロトコールの違い ライブラリーの多様性 DNA 調製方法 ギャップサイズ 多様性* スタート量 ゲルフリー 1 μg 約2~15Kb 8億6000万 ゲルあり 4 μg 約2~4Kb 5億6800万 ゲルあり 4 μg 約5~7Kb 3億9600万 ゲルあり 4 μg 約6~10Kb 1億200万 http://jp.illumina.com/content/dam/illumina- marketing/apac/japan/documents/pdf/datasheet_nextera_mate_pair_sample_prep-j.pdf 8
Slide 9: Illuminaからの提案:Sample to Answerのワークフロー
Illuminaからの提案：Sample to Answerのワークフロー NextSeq 500 Nextera mate-pair Sample Prep MiniSeq MiSeq シーケンス De novo ライブラ Fastq Assembly & リー調製 （150 bp ペ generation アエンド） Annotation Nextera 2日 ～29 時間 / ラン 12 時間 / サンプル mate-pair （ 手動 5 時間） （ 10 分） （ 5 分） （ハンズオン） 9
Slide 10: ライブラリー調製の留意点
ライブラリー調製の留意点 User Guideに従い、ライブラリー調製を実施ください。 夾雑物を含むDNAはメイトペアライブラリー調製失敗の最大原因、場合によっ ては精製が必要 Nano Dropといった吸光光度計による測定ではなく、Qubitといった蛍光ベース での測定法が必要。 測る回数を増やすことを推奨し、より正確な定量をできます。 分解したゲノムDNAはライブラリー調製に重大な影響を及ぼす、環状化がうま くいかず、好ましくないinward facing readsが増加する。 outward facing inward facing 10
Slide 11: 必要準備品 特に注意が必要なものを紹介
必要準備品 特に注意が必要なものを紹介 装置 ベンダー カタログ番号 コメント Qubit Fluorometer Invitrogen Q32866 ライブラリー定量のため使用 環状化DNA断片化のため、 Covaris AFA Ultrasonicator Covaris S2 or S220 Covarisは必要 Magnetic rack for 1.7 ml Invitrogen CS15000 1.7ml チューブ対応品 microcentrifuge tubes Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies ライブラリー定性のため使用
Slide 12: ゲノムDNAの品質確認
ゲノムDNAの品質確認 電気泳動でゲノムDNAの分解の状 態を確認 例えば、高品質のゲノムDNA主に 50 kb以上に分布することを確認で きる また、分解を進んだゲノムDNAの 泳動結果は主に29kb以下に分布 分解したゲノムDNAはライブラ リー調製に重大な影響を及ぼすた め、高品質のゲノムDNAの使用を 推奨 12
Slide 13: 1. Tagment Genomic DNA
1. Tagment Genomic DNA 以下のように試薬を調製する 55℃、30分間 Zymo Genomic DNA Clean & Concentrator Kitを用いた精製を行う (手順はUser Guideに従う) 30 μl 精製済みDNA [オプション] Agilent 2100 Bioanalyzer (DNA 12000 Kit)を用いた、断片化サイズ評価 Safe Stopping Point ①：すぐに次のステップに進まない場合は、チュー ブの蓋を閉めて-25℃~-15℃で最大24時間保管できる 13
Slide 14: 2. Strand Displacement
2. Strand Displacement このギャップを埋める 以下のように試薬を調製する 20℃、30分間 次のAMPureXPを用いた精製ステップへ 14
Slide 15: 3. Purify DNA
3. Purify DNA AMPureXPビーズを使用する30分以上前に室温に置く 必ず当日に70%エタノールを調製 ビーズとDNAの 割合は要注意 Safe Stopping Point ②：すぐに次のステップに進まない場合は、チュー ブの蓋を閉めて-25℃~-15℃で最大７日間保管できる 15
Slide 16: 4. Select Fragment Size
ゲルあり 4. Select Fragment Size (断片化DNAのサイズ選択) ゲルありプロトコールのみ このステップでは、アガロースゲルまたはSAGE社の Pippin Prepゲルを用いて、サイズ選択を行います。 両方法のライブラリーサイズの回収範 囲を要注意 Pippin Prepでは1サンプルあたり一つのサイズを 選択することが可能 アガロースゲルでは1サンプルあたり複数のサイ ズを切り出すことが可能 16
Slide 17: 5. Circularize DNA
5. Circularize DNA このステップではリガーゼを用いて環状化DNAを形成する。 AMPureXP精製を行ったDNAをQubit High Sensitivity Kitにより、濃 度を算出する 重要!! 適切なDNA分子濃度と反応条件により、1分子のセルフライゲーションによる環状化反応を行います。 ゲルフリープロトコル: 250~ 700 ngを用いる ゲルありプロトコル: 150~ 400 ng 30℃、オーバーナイト (12~16時間) 17
Slide 18: 6. Remove Linear DNA
6. Remove Linear DNA このステップでは環状化していないDNA断片を、 Exonucleaseを用いて取り除く。 300 μl Circularization反応液 環状化しなかったDNAはExonucleaseで分解 9 μl Exonucleaseを加える 37℃、30分間 70℃、30分間 12 μl Stop Ligation Bufferを加える そのまま、Shear Circularized DNAの工程へ 18
Slide 19: 7. Shear Circularized DNA
7. Shear Circularized DNA このステップでは環状化されたDNAを短いDNA （300~1,000 bp）に断片化する Covaris T6 glass tube (容量~320 μl) を用いて、Sシリー ズのCovarisであれば、以下の条件で断片化 Covaris T6 glass tube Tips Covaris M220をご使用のお客様は断片化サイズが300 bpぐらいで切断くださ い。Micro tubeの場合は、複数回に分ければ問題ない 断片化したDNAは、そのまま次のステップStreptavidin Bead Bindingへ 19
Slide 20: 8. Streptavidin Bead Binding
8. Streptavidin Bead Binding このステップではジャンクションアダプ ターに存在するビオチンタグ（B）を含むサブフラグ メントをストレプトアビジンビーズを結合して集めます。 a. ビーズの準備 20 μl streptavidin M280 Dynabeads ビオチンタグ（B） 40 μl Bead Bind Bufferによる洗浄を2回 300 μl Bead Bind Bufferに再懸濁 b. ビーズへの結合 ビオチンタグ（B） 300 μl Sheared DNA 300 μl 洗浄したStreptavidin Beadを加える 2分ごとに懸濁しながら、20
Slide 21: 9. End Repair & A-tailing
9. End Repair & A-tailing このステップでは、DNA末端の修飾を行う。DNAはビーズに 結合しており、ビーズにDNA結合した状態での反応となる。 DNAが結合したビーズ 100 μl End Repair Reaction Mixを加え、 タッピングして懸濁を行 う 30℃、30分間 200 μlのBead Wash Bufferで４回洗浄を行う 200 μlのResuspension Buffer で２回洗浄を行う 30 μl A-Tailing Reaction Mixを加え、 タッピングして懸濁を行 う 37℃、30分間 ビーズの洗浄はここでは実施せずに、そのまま
Slide 22: 10. Ligate Adapters
10. Ligate Adapters このステップではインデックスアダプターをA-tailingを 実施したDNA断片に連結する A-tailingの反応液にAdapter Ligationの反応液を加えていく 30℃、10分間 5 μl Ligation Stop Bufferを加える 200 μlのBead Wash Bufferで４回洗浄を行う 200 μlのResuspension Buffer で２回洗浄を行う ビーズにDNA結合した状態で次のPCR Amplificationのステップへ キットには12種類のインデックスプライマーが付属しています 22
Slide 23: 11. PCR Amplification
11. PCR Amplification このステップではアダプターを連結したDNA分子を増 幅する。 ビーズに以下のPCR Reaction Mixを加え、懸濁する 以下の条件でPCRを行う PCRのサイクル数は実験条件により変わる ゲルフリーであれば10サイクルでの実施 Safe Stopping Point ③：すぐに次のステップに進まない場合は、チュー ブの蓋を閉めて-25℃~-15℃で最大７日間保管できる 23
Slide 24: 12. Purify DNA
12. Purify DNA AMPureXPビーズを使用する30分以上前に室温に置く 必ず当日に70%エタノールを調製 増幅したPCR産物のチューブはマグネットスタンドに乗せ、１分間待つ PCR産物のチューブから45 μlの上清(PCR産物)を新 1.7mlチューブに移して、30 μl AMPureXPビーズを加 えて懸濁を行う 室温で5分間、さらにマグネットスタンドに乗せて5分間 マグネットスタンドに乗せたまま、 200 μlの70%エタノールで2回洗浄を行う マグネットスタンドに乗せて10-15分間の風乾 20 μlのRSBを加えて室温で5分間、さらにマグネットスタンドに乗せて5分間 マ
Slide 25: 13. Validate Library
13. Validate Library (ライブラリーの定性と定量) 定性： Agilent 2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA chipを用いて行 う qPCRによるライブラリーの定量 をお勧めします。 ライブラリーサイズ: 300~ 1500bp程度 DNA濃度 ゲルフリープロトコル: 5~ 50 nM ゲルありプロトコル: 1.5~ 20 nM 25
Slide 26: Illuminaからの提案:Sample to Answerのワークフロー
Illuminaからの提案：Sample to Answerのワークフロー NextSeq 500 Nextera mate-pair Sample Prep MiniSeq MiSeq シーケンス De novo ライブラ Fastq Assembly & リー調製 （150 bp ペ generation アエンド） Annotation Nextera 2 日以内 ～29 時間 / ラン 12 時間 / サンプル mate-pair （ 手動 5 時間） （ 10 分） （ 5 分） （ハンズオン） 26
Slide 27: バクテリアゲノムのアセンブリーに必要なシーケンス量
バクテリアゲノムのアセンブリーに必要なシーケンス量 ・大腸菌 (ゲノムサイズ: 4.6 Mb) ・Nextera Mate Pair Library Prep Kit・ゲルフリープロトコルでライブラリー調製 ・MiSeqを用いて2x150の条件でシーケンスを実施 ・Velvet de novo assembly Appを用いて、投入塩基配列量とContigとScaffoldのN50の検討を行う 250 5,000 200 4,000 150 3,000 Scaffold N50 (kb) Contig N50 (kb) 100 2,000 50 1,000 0 0 0.0 10.0 20.0
Slide 28: ゲノムサイズ5 Mbの細菌のde novoシーケンスコスト試算
ゲノムサイズ5 Mbの細菌のde novoシーケンスコスト試算 （ライブラリー調製とシーケンスコストを合わせたサンプルあたりのコスト) 注意！ Nextera Mate Pair Sample Prep Kitに付属しているインデックスは12種類までとなります。 MiniSeq MiniSeq MiSeq NextSeq De novo Mid Output 推奨リード Mid Output High Output V2 アセンブリー V2 ゲノムサイズ 長 300 cycles 300 cycles 300 cycles の 300 cycles （bp） 0.8M 2.5M 1.5M 推奨
Slide 29: ゲノムサイズ10 Mbの細菌のde novoシーケンスコスト試算
ゲノムサイズ10 Mbの細菌のde novoシーケンスコスト試算 （ライブラリー調製とシーケンスコストを合わせたサンプルあたりのコスト) 注意！ Nextera Mate Pair Sample Prep Kitに付属しているインデックスは12種類までとなります。 MiniSeq MiniSeq MiSeq NextSeq De novo 推奨リード Mid Output アセンブリー Mid Output High Output V2 ゲノムサイズ 長 V2 の 300 cycles 300 cycles 300 cycles （bp） 300 cycles 推奨データ量 0.8M 2.5M
Slide 30: Illuminaからの提案:Sample to Answerのワークフロー
Illuminaからの提案：Sample to Answerのワークフロー NextSeq 500 Nextera mate-pair Sample Prep MiniSeq MiSeq シーケンス De novo ライブラ Fastq Assembly & リー調製 （150 bp ペ generation アエンド） Annotation Nextera 2 日以内 ～29 時間 / ラン 12 時間 / サンプル mate-pair （ 手動 5 時間） （ 10 分） （ 5 分） （ハンズオン） 30
Slide 31: BaseSpaceを用いた情報解析 Velvet de novo assembly: ゲノムアセンブリー
BaseSpaceを用いた情報解析 Velvet de novo assembly: ゲノムアセンブリー ジャンクションアダプター（緑の部分） Velvet de novo assembly ア プリはNextera Mate Pairに 最適化されたアプリです。 Velvet de novo assemblyの解析ワークフロー 1. NxTrim*を用いてリードに存在するジャンクションアダプター(B)の情報から、①Single Read、②Paired-End、③Mate Pair、④Unknownに分類 2. アダプタートリムを行う 3. Velvet **による、最適なk-merを求めて
Slide 32: Velvet de novo assembly: NxTrimよりリードの分類
BaseSpaceを用いた情報解析 Velvet de novo assembly: NxTrimよりリードの分類 ジャンクションアダプターの位置によりリード情報を分類 ③Mate Pair ①Single Read ②Paired-End ③Mate Pair *Velvet de novo Assembly Version 1.0.0 **QUAST Version 2.3 ②Paired-End O'Connell, J., Schulz-Trieglaff, O., Carlson, E., Hims, M.M., Gormley, N.A. and Cox, A.J. (2015).
Slide 33: Velvetの出力ファイル-NxTrimの分類結果ファイル
Velvetの出力ファイル-NxTrimの分類結果ファイル NxTrimの出力ファイルは*.nxtrim.outです。 33
Slide 34: Velvet de novo assembly: NxTrimよりリードの分類結果
BaseSpaceを用いた情報解析 Velvet de novo assembly: NxTrimよりリードの分類結果 実際のMate Pair ライブラリーデータのNxTrim分類結果です。 判定結果 Read 1 Read 2 Mate Pair ジャンクションアダプター 365,369 40.67% (Read pairs had MP orientation) Pair End 324,525 36.12% (Read pairs had PE orientation) Single Read PE Read 2 Single Read 298,478 33.23% PE Read (
Slide 35: BaseSpaceを用いた情報解析 Velvet de novo assembly: ゲノムアセンブリー
BaseSpaceを用いた情報解析 Velvet de novo assembly: ゲノムアセンブリー ジャンクションアダプター（緑の部分） Velvet de novo assembly ア プリはNextera Mate Pairに 最適化されたアプリです。 Velvet de novo assemblyの解析ワークフロー 1. NxTrim*を用いてリードに存在するジャンクションアダプター(B)の情報から、①Single Read、②Paired-End、③Mate Pair、④Unknownに分類 2. アダプタートリムを行う 3. Velvet **による、最適なk-merを求めて
Slide 36: BaseSpace のアプリ一覧からVelvet de novo assemblyの実行
BaseSpace のアプリ一覧からVelvet de novo assemblyの実行 ①アプリタブをクリック ②“De Novo Assembly”をクリック ③“Velvet de novo Assembly”をクリック 36
Slide 37: BaseSpaceを用いた情報解析:Velvet de novo assemblyの実行
BaseSpaceを用いた情報解析： Velvet de novo assemblyの実行 BaseSpaceでは、以下の操作のみで、ゲノムアセンブリーが可能です！ ①出力ファイルが保 存するProjectを選択 ②アセンブリーするFASTQを選択 ⑤Continueをクリック！ K-merオプションはデフォルトのままでOK! 最適値をVelvetが算出します ③Nextera Mate Pair Libraryは必ず、Reverse Complementを実施する ④免責事項を確認してチェック 37
Slide 38: BaseSpaceを用いた情報解析:QUASTによるアセンブルの評価結果
BaseSpaceを用いた情報解析： QUASTによるアセンブルの評価結果 アセンブリーの結果の評価指標のN50を確認し、どれだけ長くつながったかの確認を行います 38
Slide 39: Velvetの出力ファイル-faファイル
Velvetの出力ファイル-faファイル Velvet de novo assemblyの出力ファイルは.faです。 （ProkkaのInputファイルとなります） 39
Slide 40: Prokka Genome Annotation: 遺伝子アノテーション
BaseSpaceを用いた情報解析 Prokka Genome Annotation: 遺伝子アノテーション Prokaryotic Annotation 原核生物専用の遺伝子アノテーションア プリ Velvet de novo assemblyの出力ファイル の.faがProkkaのInputファイル アセンブリーで得られたFASTA配列に annotationをつける Prokkaの主な出力ファイルは .gff : 遺伝子アノテーション情報 (GFF3形式) .gbk : 遺伝子アノテーション情報 (Genbank 形式) .faa: アミノ酸配列情報 http://www.vicbioi
Slide 41: Prokka Genome Annotationの実行
BaseSpaceを用いた情報解析 Prokka Genome Annotationの実行 Velvet de novo assembly の出力ファイル、.faを 選択 41
Slide 42: Prokka Genome Annotationの実行結果
BaseSpaceを用いた情報解析 Prokka Genome Annotationの実行結果 42
Slide 43: Prokka Genome Annotationの出力ファイル (.faa、.gbk)
BaseSpaceを用いた情報解析 Prokka Genome Annotationの出力ファイル (.faa、.gbk) .faa アミノ酸配列 .gbk 遺伝子アノテーション情報 Blast 目的機能タンパク質の探索など 43
Slide 44: Prokka Genome Annotationの出力ファイル (.gff)
BaseSpaceを用いた情報解析 Prokka Genome Annotationの出力ファイル (.gff) Artemis Genome Browser .gff 遺伝子アノテーション情報 DOUBLE ACT v2 (ゲノム構造比較) http://www.sanger.ac.uk/science/tool s/artemis Artemis Genome BrowserとDOUBLE ACT v2 がSanger Institute提供するツールです。 44
Slide 45: Nextera Mate Pair Sample Prep Kitを用いたバクテリアゲノムアセンブリーのまとめ
Nextera Mate Pair Sample Prep Kitを用いたバクテリアゲノム アセンブリーのまとめ 最少1µgのDNAから12 kbまでのギャップサイズのメイトペアライブラリーが、 二日間で調製可能です。 2x150の条件で、ゲノムサイズのx60以上(できればx100以上)の塩基配列を 取得するシーケンスを行う BaseSpaceのアプリを行えば、ゲノムアセンブリーと遺伝子アノテーションを 行うことが可能です。 ゲノムサイズ等によるが、ゲルフリープロトコールの場合、ライブラリー調製 とシーケンスのコストは、一検体当たり3~6万円程度となる。 45
Slide 46: Nextera Mate Sample Prep Kitに関連するウェビナー
Nextera Mate Sample Prep Kitに関連するウェビナー 2016.4.14 【イルミナiSchool プロフェッショナル】 NGSをより深く知り、よりうまく使うための試み 理化学研究所ライフサイエンス技術基盤研究センター(CLST) 工樂 樹洋 先生 【要旨】 次世代シークエンスは、費用がかかるだけでなく、技術的な相談相手が限られ、そして結 果の評価も簡単ではない。本ウェビナーでは、こういった 壁を乗り越えるべく、おもに 非モデル生物のゲノム・トランスクリプトーム解析を対象として、イルミナシークエンサ やサンプル調製キットを利用 するにあたり実践してきた様々な試みを紹介す
Slide 47: ご清聴ありがとうございました
ご清聴ありがとうございました 本日セッション終了後のご質問は、 techsupport@illumina.comにお問い合わせください 47