Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (November 2015)
29 slides from Illumina's technical presentation, Nov 20, 2015
Slide 1: ターゲットサイトに絞ったカスタムライブラリーのシーケンス
ターゲットサイトに絞った カスタムライブラリーのシーケンス November 20, 2015 崎川 真里 イルミナ株式会社 テクニカルアプリケーションサイエンティスト © 2015 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cBot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, ForenSeq, Genetic Energy, GenomeStudio, GoldenGate, H
Slide 2: ターゲットサイトに絞ったシーケンスとは？
ターゲットサイトに絞ったシーケンスとは？ 全ゲノムシーケンス ターゲットシーケンス 特徴 特徴 ・全ゲノムを包括的に解析可能 ・興味のある領域のみを高いカバレッジ ・構造変異を含む様々なタイプの変異を で解析可能 検出できる ・多サンプルを一度に解析できる 考慮すべき点 考慮すべき点 ・コストが割高 ・ターゲット領域外の変異情報は検出 ・カバレッジは通常x30程度 できない ・データ量が多く解析が煩雑 ・ターゲットとする遺伝子について 既知の情報が必要 例 例 ・ヒト全ゲノムシーケンス ・エクソームシーケンス ・微生物de novoシーケンス など ・疾患別パネル ・16S 菌叢解析 など 2
Slide 3: こんなことでお困りではないでしょうか
こんなことでお困りではないでしょうか カスタムライブラリーを作製したいが、どのようにデザインすればよいのか わからない カスタムプライマーを作製したものの、シーケンスでのデータが得られない カスタムライブラリーをシーケンスする際のランの設定がわからない ランは完了したがDemultiplexingがうまくいかない 3
Slide 4: 本セッションのご注意事項
本セッションのご注意事項 本セッションはカスタムライブラリーのラン成功を保証するものではありません – ご留意いただく点をお伝えするセッションになります。 – カスタムライブラリー（弊社ライブラリー調製キットを使用されないライブラリー） の作製については、サポート外とさせていただいております。 考慮すべき点が多く、各ライブラリーについて弊社で検証を行っていないためです。 カスタムライブラリーを使用されたランの装置のトラブルシュートはお手伝い致します。 本セッションの内容は、以下の資料をもとに作成しています – David R. Bentley et al. (2008) Accurat
Slide 5: 本日の内容
本日の内容 カスタムライブラリーのデザイン カスタムライブラリーを使用したMiSeqランのセットアップ 5
Slide 6: 本日の内容
本日の内容 カスタムライブラリーのデザイン カスタムライブラリーを使用したMiSeqランのセットアップ 6
Slide 7: ライブラリーのデザインにあたり、必要な配列
ライブラリーのデザインにあたり、必要な配列 アダプター アダプター A : フローセル（FC）に結合するために必要な配列 B : シーケンスプライマー（Seq Primer）が結合する配列 C : シーケンスされるDNA（インサート） D : Index（サンプルを区別するためのバーコード配列） － どれも必要な配列です。 7
Slide 8: シーケンスの流れ
シーケンスの流れ - Single Read(SR)とPaired End(PE)の違い SR PE SBS (Sequencing By Synthesis) ケミストリーとは何か？ http://www.illuminakk.co.jp/documents/pdf/2015_techsupport_session9.pdf 8
Slide 9: ライブラリーの調製
ライブラリーの調製 - TruSeqライブラリーの場合（例 TruSeq Nano DNA kit） A) DNAの断片化 B) 末端の平滑化、5’末端リン酸化 C) サイズ選択 D) A付加 E) インデックス付アダプターのライゲーション F) PCR F 9
Slide 10: TruSeqライブラリーの配列とは
TruSeqライブラリーの配列とは アダプター配列 Index2(i5) Adapters - D501-508 5’ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[TATAGCCT]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC T P5配列 i5 Index1(i7) Adapters - D701-712 5’ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[CGAGTAAT]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG Y字形成用配列 i7 rP7配列 Y字を形成している i5 GCTCTTCCGATCT GTTCGTCTTCTG
Slide 11: TruSeqライブラリー調製キットで作製されるライブラリー
TruSeqライブラリー調製キットで作製されるライブラリー Y字アダプターライゲーション後の二本鎖DNAの構造 GCTCTTCCGATC T NNN…NNN A GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGAGTAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTATAATGAGCCACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAG A NNN…NNN T CTAGCCTTCTCG PCR後 P5 i7 i5 rP7 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCT
Slide 12: Read1 配列を読むときのライブラリー構造
Read1 配列を読むときのライブラリー構造 Read1 – FC上にP7配列を下にしてクラスターが立っている状態 P7配列 ri7 ri5 rP5 FC|5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAAT-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-T[NN]A-GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-AGGCTATA-GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTACATT <=T-CTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACA [possible R1 Sequence Primer] <=TCTAG
Slide 13: Index1 配列を読むときのライブラリー構造
Index1 配列を読むときのライブラリー構造 Index1 Read (i7) – FC上にP7配列を下にしてクラスターが立っている状態 P7配列 ri7 ri5 rP5 FC|5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAAT-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-T[NN]A-GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-AGGCTATA-GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTACATT <=CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAG [possible Index1 Sequence
Slide 14: Dual Index, Index2の読み方
Dual Index, Index2の読み方 SRとPEで異なる SR PE 14
Slide 15: Index2 配列を読むときのライブラリー構造
Index2 配列を読むときのライブラリー構造 Index2 Read (i5) – SRの場合: FC上にP7配列を下にしてクラスターが立っている状態 P7配列 ri7 ri5 rP5 FC|5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAAT-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-T[NN]A-GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-AGGCTATA-GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTACATT i5 <=CACATCTAGACCACCAGCGGCATAGTAA [possible Index2 Sequ
Slide 16: Index2 配列を読むときのライブラリー構造
Index2 配列を読むときのライブラリー構造 Index2 Read (i5) – SRの場合: FC上にP7配列を下にしてクラスターが立っている状態 P7配列 ri7 ri5 rP5 FC|5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAAT-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-T[NN]A-GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-AGGCTATA-GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTACATT i5 <=CACATCTAGACCACCAGCGGCATAGTAA [possible Index2 Sequ
Slide 17: Read2 配列を読むときのライブラリー構造
Read2 配列を読むときのライブラリー構造 Read2 – FC上にP5配列を下にしてクラスターが立っている状態 P5配列 i5 i7 FC|5’-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-TATAGCCT-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-[NN]A-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGAGTAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG <=T-CTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTG [possible Read2 Sequence Primer] <=TCTAGCC
Slide 18: カスタムライブラリーに必要な配列のまとめ
カスタムライブラリーに必要な配列のまとめ MiSeqで使用するアダプター＆プライマー配列 – DNAインサートの両端に下記塩基配列がついたDNAを調製すれば解析可能 18
Slide 19: 本日の内容
本日の内容 カスタムライブラリーのデザイン カスタムライブラリー使用したMiSeqランのセットアップ – Seq Primer – サンプルシートの作成 19
Slide 20: MiSeqのランで使用するSeq Primerは？
MiSeqのランで使用するSeq Primerは？ イルミナのSeq Primerを使用 – イルミナのアダプター配列と同じ配列をもつライブラリー（TruSeq、Nextera ） – 試薬カートリッジにセットされた通常のプライマー カスタムのSeq Primerを使用 – カスタムのアダプター配列をもつライブラリー – MiSeqのSeq Primerアニーリング温度を考慮したプライマーの設計が必要 – MiSeqの場合は65℃ https://my.illumina.com/MyIllumina/Bulletin/q15y583ofUi3U5DU3e45cw/sequencing- pri
Slide 21: 1）イルミナのSeq Primerを使用する
1）イルミナのSeq Primerを使用する 試薬カートリッジ内の通常のプライマーでシーケンス可能 – Read1 Primer Mix(12番)、Index Primer Mix（13番）、Read2 Primer Mix（14番） – 17番ポートに変性・希釈済みのサンプルを入れるだけ 21
Slide 22: 2）カスタムのSeq Primerを使用する
2）カスタムのSeq Primerを使用する カスタムライブラリーのみを流す場合 試薬カートリッジの専用ポートにカスタムプライマーを投入 – Read1 (18番)、Index（19番）、Read2 （20番） https://support.illumina.com/content/dam/illumina- support/documents/documentation/system_documentation/miseq/miseq_using_custom_primers_15041638_b.pdf 各ポートには0.5 uMに希釈したカスタムプライマーを600 uL加える – 必ずサ
Slide 23: 3）カスタムのSeq Primerを使用する
3）カスタムのSeq Primerを使用する カスタムライブラリーにPhiXをスパイクインする場合 通常のプライマー（12番、13番、14番）にカスタムプライマーを混合 https://my.illumina.com/MyIllumina/Bulletin/8EkhELfE-EqVqVOg9bKqMg/using-custom-primers-on-illumina-sequencing-platfo 12: Read1 – 680uL入りのため100 uMのRead1カスタムプライマーを3.4 uL添加 13: Index – 680uL入りのため100 uMの Index カスタムプライマ
Slide 24: MiSeqランのためのサンプルシート
MiSeqランのためのサンプルシート Illumina Experiment Manager(IEM)を使用してサンプルシートを作成 http://www.illuminakk.co.jp/documents/pdf/2015_techsupport_session1.pdf カスタムSeq Primerを使用した場合 – 試薬カートリッジの該当するポートを指定 カスタムライブラリーでイルミナのキットにないindexを使用した場合 – 作成したサンプルシートのindex配列をNotePad等のテキストエディタで編集 24
Slide 25: カスタムSeq Primerを使用するランの設定
カスタムSeq Primerを使用するランの設定 IEMにてInstrument Selection>MiSeq Application Selection>Workflow Parameters カスタムSeq Primerの専用ポートの選択 – 試薬カートリッジの18、19、20番を使用する場合は、各項目にチェックを入れる。 – PhiXをスパイクインする場合は、カスタムSeqPrimerは通常のプライマーのポート に混合するので、チェックは入れないこと。 25
Slide 26: カスタムで作製したindex配列を設定したい
カスタムで作製したindex配列を設定したい サンプルシートをNotePad（メモ帳）で開くと、以下のような内容が表示される。 – 表示項目のうち、各サンプルのindex名とindex配列を、カスタムライブラリーの作製に 使用したReverseプライマー情報等を参照しながら書き換える。 – 書き換え部分周辺のカンマ(,)は消さないこと。構成が崩れると、サンプルシートが正し く機能しなくなる。 index配列について編集する 26
Slide 27: カスタムで作製したindex配列を設定したい
カスタムで作製したindex配列を設定したい カスタムライブラリー作製時に使用したプライ マーの情報をもとに、全てのサンプルに対して情 報の書き換えを実施する – 書き換えが終わったら上書き保存して編集を終了 する。 出来上がったサンプルシートは、MCSが参照する所定 のフォルダに配置する – サンプルシートの参照先を変更していなければ、以下の 場所に保管すれば良い D:¥Illumina¥MiSeq Control Software¥SampleSheets 27
Slide 28: 本日のまとめ
本日のまとめ カスタムライブラリーデザインの際には以下の点に注意する – P5/P7配列の並び – Seq Primerがハイブリするサイト 一度でうまくいくとは限らない – うまくいかない場合はCorresponding Authorにお問い合わせ ラン条件の設定に注意する – 試薬カートリッジへのカスタムプライマーの投入 – サンプルシート作成 28
Slide 29: サポート資料
サポート資料 David R. Bentley et al. (2008) Accurate whole human genomesequencing using reversible terminator chemistry. Nature 456 Illumina Adapter Sequences Document – https://support.illumina.com/downloads/illumina-customer-sequence-letter.html Using Custom Primers on the MiSeq (15041638B) – https://su