Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (January 2019)
68 slides from Illumina's technical presentation, Jan 31, 2019
Slide 1: やってみよう! single cell RNA-seq解析ことはじめ
2019年01月31日 やってみよう! single cell RNA-seq解析ことはじめ 東京大学 定量生命科学研究所 林 寛敦
Slide 2: scRNA-seq解析のワークフロー
scRNA-seq解析のワークフロー ddSEQ ddSEQ Single-Cell Isolator (BIO-Rad) SuewCell WTA 3’ Library Prep Kit (illumine) Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Cell Isolation その他 Cell Ranger 3rd. パーティー Library Preparaion (Chromium: 10xgenomics) etc. （Flo
Slide 3: scRNA-seq解析のワークフロー ddSEQの例
scRNA-seq解析のワークフロー ddSEQの例 ddSEQ Single-Cell Isolator (BIO-Rad) SuewCell WTA 3’ Library Prep Kit 本日のメインテーマ (illumine) Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Cell Isolation CellRanger その他 Library Preparaion (Chromium: 10xgenomics) 3rd. パーティ
Slide 4: 本日の流れ
本日の流れ 1細胞RNA-seq (scRNA-seq)のワークフロー ddSEQのデータを用いた解析事例 - 解析の流れ・解析環境 ・ BaseSpase → R (Seurat2) - R package Seurat2による解析 ・ データのクオリティチェック ・ 細胞のクラスタリング ・ クラスター間で発現量に差がある遺伝子の抽出 ・ クラスターのアノテーション - chromiumのデータとの比較 腫瘍検体のscRNA-seq解析事例 - monocle, velocytoによる解析例
Slide 5: 本日の流れ
本日の流れ 1細胞RNA-seq (scRNA-seq)のワークフロー ddSEQのデータを用いた解析事例 - 解析の流れ・解析環境 ・ BaseSpase → R (Seurat2) - R package Seurat2による解析 ・ データのクオリティチェック ・ 細胞のクラスタリング ・ クラスター間で発現量に差がある遺伝子の抽出 ・ クラスターのアノテーション - chromiumのデータとの比較 腫瘍検体のscRNA-seq解析事例 - monocle, velocytoによる解析例
Slide 6: Experimental Design / Sequence Processing Reads
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Experimental Design Sequence Processing Reads
Slide 7: Single cell RNA-seqの解析プラットフォームは多数
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Single cell RNA-seqの解析プラットフォームは多数 目的に応じた解析プラットフォームの選択が重要
Slide 8: 主にNGSによる1細胞解析の情報が網羅的にまとめられている
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix ・ 様々な学術分野の動向を網羅 (Application) ・ 1細胞を取得する技術の紹介 (Sample Preparation) ・ データ解析ツールの紹介 (Data Analysis) ・ DNA ・ Epigenome に関する1細胞解析手法の紹介 ・ RNA 手法ごとにメリット・デメリットが記載 充実した参考文献 主にNGSによる1細胞解析の情報が 網羅的にわかりやすくまとめられている
Slide 9: Isolation
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Isolation Manual Auto Sampling Picking MicroFluidics FACS ddSEQ (Bio-Rad) Fluidigm C1 Chromium (10x genomics) Hwang et al., Exp. Mol. Med. 50: 96 (2018) その他、様々な手法が存在
Slide 10: Library Preparation
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Library Preparation 代表的な手法の例 UMI = 分子バーコード = Unique mRNA Full-length or 3’end? Number of cells? Hwang et al., Exp. Mol. Med. 50: 96 (2018) Read depth? Cost?
Slide 11: Smart-seq v2 / Droplet-base
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Smart-seq v2 Droplet-base Full-length 3’end UMI 1 cell – 1 reaction Pooled Capture Poly (A)+ RNA Reverse Transcription & Template switching PCR preamplification Tagmentation (Tn5) Index PCR & Sequenci
Slide 12: 代表的な手法の比較
代表的な手法の比較 Smart-seq Droplet-base 配列・定量 全⾧配列 3’ 部分配列 （リード数） (UMIによるカウント) 細胞数 100~384 cells 1,000-10,000 cells/well 1細胞当たりの同 3,000遺伝子以上 1,500～6,000遺伝子 定遺伝子数 （比較的安定） （細胞種による） 任意の細胞の再解析が可能 再解析 （個々の細胞が別ライブラリー） 個別の再解析不可能 qRT-PCRも可能 集団構成推定が難しい 1細胞当たりの情報量が少ない 特徴 （狭く深く） （広く浅く） アイソフォームの解析可能 多数の細胞を解析可能 シーケンスコス
Slide 13: シーケンス例 Hiseq / NOVA-seq 6000
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix シーケンス例 Hiseq Rapid SBSキット V2 リード⾧ 100 bp x 2 シングルフローセル 50~60G ランタイム 27時間 リード数 3 億ペアリード Hiseq2500 Rapid クオリティ 100bp x 2で、80%以上の塩基がQ30を超える Chromium (10x genomics)で調製した2,000細胞のサンプルを3サンプル分、合計6,000細胞をシーケンス
Slide 14: scRNA-seq解析パイプライン例 BaseSpace
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix scRNA-seq解析パイプライン例 BaseSpace ・直感的に操作可能 ・主要アプリケーションを搭載 全ゲノム解析 エクソーム解析 RNA-seq解析 scRNA-seq解析 (ddSEQ) FASTQ 腫瘍/正常細胞解析 など ファイル FASTQ file の処理 Cell Ranger ・10x genomicsが提供する STAR etc. NGS solutionのデータを解析 B
Slide 15: ここまでのまとめ
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix ここまでのまとめ 研究目的に適した解析プラットフォームを選択する - 予算 - 細胞数・リード数 - 全⾧ or 3’end - 細胞の取得方法・ライブラリー調製方法 シーケンスのコストをさげることはできる - 多数のサンプルでNova-seq サーバーやLinuxのスキルがなくとも解析できる方法はある - BaseSpaceの活用 ddSEQ (Droplet-base)やNexteraによって
Slide 16: 本日の流れ
本日の流れ 1細胞RNA-seq (scRNA-seq)のワークフロー ddSEQのデータを用いた解析事例 - 解析の流れ・解析環境 ・ BaseSpase → R (Seurat2) - R package Seurat2による解析 ・ データのクオリティチェック ・ 細胞のクラスタリング ・ クラスター間で発現量に差がある遺伝子の抽出 ・ クラスターのアノテーション - chromiumのデータとの比較 腫瘍検体のscRNA-seq解析事例 - monocle, velocytoによる解析例
Slide 17: Prepare Expression Matrix
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Prepare Expression Matrix
Slide 18: Data Analysis Pipeline for ddSEQ
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Library Preparation Hiseq2500 Rapid FASTQ ddSEQ Single-Cell Isolator SureCell WTA 3’ Library Prep Kit ファイル (Bio-Rad) (illumine) FASTQ file の処理 Data Analysis Pipeline for ddSEQ STAR etc. Bam file RSEM
Slide 19: 遺伝子発現マトリックス
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix 遺伝子発現マトリックス Cells 大体の場合は、 遺伝子発現マトリックスを使用して 3次解析 (データの解釈, Biological Interpretation) Ex. 発現量解析 Gene Expression Matrix Genes クラスタリング (Raw count, RPKM, TPM, UMI etc.) http://www.people.vcu.edu/~mreimers/
Slide 20: ddSEQのデータを用いた解析事例
ddSEQのデータを用いた解析事例 ・ Sample Mixture of 4 cultured cell lines 3 Ovarian Clear Cell Carcinoma (OCCC) Cell Lines OVISE JHOC5 ES2 1 Ovarian Surface Epithelial Cell Line OSE3 ・ Target number of cells 1,200 cells (4 well)
Slide 21: Sequence Summary (ddSEQ)
Sequence Summary (ddSEQ) 解析結果 (BaseSpace) 想定通りの細胞数がFilterを通過している
Slide 22: Preparing Expression Matrix from BaseSpace
Preparing Expression Matrix from BaseSpace プロジェクトの解析結果の画面 プロジェクト名 ここから解析結果をまとめてダウンロード （Bam fileなどを含む全てのファイル) QCの結果、tSNEplotなど簡単な3次解析を含む解結果を閲覧可能 BaseSpaceから遺伝子発現マトリックスを取得する方法は他にもあります これからの説明はあくまでも1例です
Slide 23: ダウンロード先をBaseSpaseフォルダに指定した場合
ダウンロード先をBaseSpaseフォルダに指定した場合 プロジェクト名 よほどのことがない限りこれでOK 良好な状態の細胞のみの遺伝子発現マトリックス サマリー 解凍 → 展開 csvファイル 全ての細胞 (バーコード) の遺伝子発現マトリックス Web上のAnalysisタブで閲覧できる結果のpdf版
Slide 24: 良好な状態の細胞??
良好な状態の細胞?? 細胞のダメージが少ない 適切な情報（遺伝子発現データ）を有している細胞 良好な状態の細胞 各細胞で検出されたUMI数 累積UMI数 ( = mRNA数) 細胞 細胞
Slide 25: 解析に使用する細胞を自分で選びたい
解析に使用する細胞を自分で選びたい サマリー 全ての細胞 (バーコード) の遺伝子発現マトリックス 解凍 → 展開
Slide 26: Long Formatの形式
解析に使用する細胞を自分で選びたい Wide Format Long Format Long Formatの形式 UMI 細胞バーコード 遺伝子 Count 一般的な遺伝子発現マトリックス (http://genomespot.blogspot.com/2018/11/using-dee2-bulk-data-dumps.html) ・ Long Formatは、整然データ (Tidy Data)の形式 ・ Long Formatはデータ分析に扱いやすい形式 ・ WideとLongは相互変換可能 (R: tidyr package etc. ) 整然データの詳細な解説 整然データとは何か —
Slide 27: Biological Interpretation
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Biological Interpretation
Slide 28: 遺伝子発現マトリックスを使用してどのように解析したらよい?
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix 遺伝子発現マトリックスを使用してどのように解析したらよい?
Slide 29: scRNA-seq用の解析ツールは毎年かなりの数が開発されている
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix scRNA-seq用の解析ツールは毎年かなりの数が開発されている PLoS Comput Biol. 14:e1006245 (2018).
Slide 30: Rに対応したツールが非常に多い!
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Rに対応したツールが非常に多い! Rがおすすめ! PLoS Comput Biol. 14:e1006245 (2018).
Slide 31: 解析環境 (R)
解析環境 (R) ・ OSを選ばない - MacでもLinuxでも、windowsでも! ・ 基本的な使用方法について解説したページが多数 - Rjp Wiki など - (Rで)塩基配列解析 門田先生 ・ 書籍数も多い ・ 様々な解析ツールがpackageという形で提供されている ・ scRNA-seqを含むNGS解析に特化したpackageが多数提供されている - Bionconductor ・ 対話型 - エラーが起きても、エラー内容がわかりやすい
Slide 32: RのどのscRNA-seq解析用ツールを使用すればよいの?
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix RのどのscRNA-seq解析用ツールを使用すればよいの? 同じことをやれそうなツールがたくさん! 個人的な見解としては、 実際に使用してみて研究目的と相性が良いものを選ぶしかない
Slide 33: Seurat (R package)
scRNA-seq解析のおすすめRパッケージ Seurat (R package) SATIJA Lab: http://satijalab.org/seurat/ ・ チュートリアル、FAQが充実 ・ QC、filtering、clusteringなどscRNA-seqの一連の解析をAll-in-oneで可能 ・ Gene Expression Matrixがあれば、解析可能 ・ メモリにやさしく動作が非常に軽快 ・ 異なる手法のデータセットを結合し、Normalizationやbatch effectの除去が可能 ・ DEGの手法の選択が多様 ・ 日進月歩のscRNA-seq解析手法を素早
Slide 34: Analysis of single cell RNA-seq data
Analysis of single cell RNA-seq data GitHubにあるサンガー研究所 Martin Hembergチームによる scRNA-seq解析トレーニングコース https://hemberg-lab.github.io/scRNA.seq.course/index.html Seuratだけが独立した項目として解説されている Seuratは現時点 (2019年1月)において、scRNA-seq解析のスタンダード と言えるかも? 少なくとも最初に使用するツールとしてはおすすめ 非常に参考になりますので、興味ある方は是非 （「Hemberg scRNA」などで検索!
Slide 35: 本日の流れ
本日の流れ 1細胞RNA-seq (scRNA-seq)のワークフロー ddSEQのデータを用いた解析事例 - 解析の流れ・解析環境 ・ BaseSpase → R (Seurat2) - R package Seuratによる解析 ・ データのクオリティチェック ・ 細胞のクラスタリング ・ クラスター間で発現量に差がある遺伝子の抽出 ・ クラスターのアノテーション - chromiumのデータとの比較 腫瘍検体のscRNA-seq解析事例 - monocle, velocytoによる解析例
Slide 36: 解析の準備-1 Rstudioをインストール
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix 解析の準備-1 Help 1. Rのための統合開発環境Rstudioをインストール 困ったらココ!! ② Source Editor Rのスクリプトを編集 2 4 ここからコードの実行も可能 ④ Environment 作成したデータや変数の確認 実行履歴 ③ File, Plots, Packages など 3 Fileへのアクセス 1 Plotデータの出力 R packageの管理、ヘルプ な
Slide 37: 解析の準備-2 Seurat Packageをインストール
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix 解析の準備-2 2. RstudioにSeurat Packageをインストール 以前の 最新の 開発中 version β版 安定版 RstudioのConsoleに入力 更新頻度が高いので 定期的にアップデートを 確認すると良い
Slide 38: Seurat web Site
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Seurat web Site Get Started → Guided Tutorial –2,700 PBMCs
Slide 39: Seurat
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix Seurat 1. Seurat object class 遺伝子発現マトリックスをSeurat object classへ変換 2. Expression QC 解析に使用する良好な細胞、遺伝子をフィルタリング 3. Normalization 4. Highly variable genes 5. Dealing with confounders 6. Linear dimensionalit
Slide 40: 解析環境 sessionInfo
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix 解析環境 > sessionInfo() R version 3.5.0 Patched (2018-05-30 r74806) Platform: x86_64-w64-mingw32/x64 (64-bit) #Windows10 Pro Running under: Windows >= 8 x64 (build 9200) Matrix products: default locale:
Slide 41: Mixture of 4 cultured cell lines
・ Method ddSEQ (Droplet-base) ・ Sample Mixture of 4 cultured cell lines 3 Ovarian Clear Cell Carcinoma (OCCC) Cell Lines OVISE JHOC5 ES2 1 Ovarian Surface Epithelial Cell Line OSE3 ・ Target number of cells 1,200 cells (4 well) 上記のデータを RのSeurat packageを使用して解析してみる
Slide 42: Gene Expression Matrixの取り込み
Gene Expression Matrixの取り込み BaseSpaceによって生成されたカンマ区切り (CSV形式) の遺伝子発現マトリックスを データフレームとして読みこむ 例 library(Seurat) library(dplyr) df <- read.table(file =“PATH/TO/YOUR/GENE/EXPRESSION/MATRIX/FILE”, #ファイルの場所を指定 sep = “,”, #csvファイルなので、カンマ区切りを指定 #タブ区切りの場合は、”¥t” header = TRUE, #先頭の行が列名の時は、TRUEに row.names = 1, #
Slide 43: Gene Expression Matrixの取り込み
Gene Expression Matrixの取り込み データフレーム形式からマトリックス形式への変換 例 mat <- as.matrix(df) ##行と列の入れ替え mat <- t(mat) ##以下は SparseMatrixへの変換 (現在のSeuratのバージョンでは必要ない) s.mat <- as(mat, "sparseMatrix") s.mat[1:4,1:5] 行（遺伝子）-列（細胞）のマトリックスに変換された 参考: SaprseMatrix
Slide 44: 遺伝子発現マトリックスをSeurat Objectへ
遺伝子発現マトリックスをSeurat Objectへ 例 ddseq <- #Seurat Objectの名前（任意） CreateSeuratObject( #Seurat Objectを作成するためのコマンド raw.data = mat, #用意した遺伝子発現マトリックスを指定 min.cells = 3, # 遺伝子フィルター min.genes = 200, # 細胞フィルター project = “ddSEQ“ #プロジェクト名（任意） ) min.cells = 3 最低限、3つの細胞以上で発現が検出されている遺伝子のみを解析に使用 min.genes = 200 最低限、200
Slide 45: CreateSeuratObject ()の例
コマンドの内容を詳しく知りたい CreateSeuratObject ()の例 Rsutdioの右下の分割画面にあるpackagesタブからSeuratを選択 ↓ Helpのタブに切り替わり、Seuratの命令文一覧が表示 ↓ CreateSeuratObjectを選択 (左図) min.cellsやmin.genesが何を指定するものか記載されている 引数名 Usageにはdefautでの設定も記載されている 例えば、 min.cellsやmin.genesの値を特に指定しなかった場合、 min.cells = 0, min.genes = 0として処理される （つまりは、フィルター無し)
Slide 46: QC and selecting cells for further analysis
QC and selecting cells for further analysis nGene nUMI Percent.mitocondria nGene nUMI Good correlation between nUMI and nGene Low percent of Mitocondria genes
Slide 47: QC and selecting cells for further analysis
QC and selecting cells for further analysis 例 ddseq <- FilterCells( #細胞をフィルターするためのコマンド object = ddseq, #解析するSeuratObject subset.names = c(“nGene”, “percent.mito”), #フィルタリングに使用する情報 low.thresholds = c(-Inf, -Inf), #下限 high.thresholds = c(5000, 0.1) #上限 ) low.thresholds = c(-Inf, -Inf) 細胞ごとの遺伝子数 (nGene
Slide 48: Normalizing the data
Normalizing the data 例 ddseq <- NormalizeData( object = ddseq, normalization.method = “LogNormalize”, #Normalizationの方法 scale.factor = 10000) #RNA-seqのRPKMやTPMのM (106)に相当 scale.factor = 10000 細胞ごとのカウント数 (リード数またはnUMIなど）を10,000に揃える
Slide 49: Normalization後のデータはどこ?
Normalization後のデータはどこ? Normalized Gene Expression Matrix ddseq@data ddseq@data[200:204, 100:104] #200~204番目の５つの遺伝子と100～104番目の5つの細胞を抽出 SparseMatrixの形式で格納されている Raw Gene Expression Matrix ddseq@raw.data BaseSpaceで生成された遺伝子発現マトリックスと同じ（ただし、形式はSparse Matrix) Z-score SparseMatrixから通常のMatrixへの変換は、as.matrix()
Slide 50: Perform linear dimensional reduction
Perform linear dimensional reduction 解析に使用する次元削減手法とその数を決定する 例 ddseq <- RunPCA( #主成分解析 object = ddeseq, pc.genes = ddseq@var.genes, #予め算出した細胞間で分散が大きい （発現変動が大きい）遺伝子リスト do.print = TRUE, #結果を出力するか否か pcs.print = 1:10, #結果を出力するか主成分の数 genes.print = 10, #出力する遺伝子の数 pcs.compute = 50 #計算する成分の数 ) #今後の解析に使用する成分の
Slide 51: Perform linear dimensional reduction
Perform linear dimensional reduction PCElbowPlot(object = ddseq, num.pc = 50) 1 今回は成分6（PC=6）までを使用 2 マイナーポピュレーションの細胞の同定など 3 細かく分類したい場合は成分数を増やす 4 5 6
Slide 52: Clustering
Clustering 例 ddseq <- FindClusters( #細胞を分類するためのコマンド object = ddseq, reduction.type = “pca”, #次元削減の手法名 dims.use = 1:6, #解析に使用する次元数 resolution = 0.2, #クラスタリングの解像度 #値が大きいほど細かくクラスタリング #複数の解像度を指定可能 (ex. resolution = c(0.2, 0.8, 1.2)) print.output = 0, save.SNN = TRUE ) パラメーターが多数あるので、最適なクラスタリング結果になるように調整す
Slide 53: クラスタリングの結果はどこ?-1
クラスタリングの結果はどこ?-1 ddseq@meta.data head(ddseq@meta.data) FindClusters()で複数の解像度を指定した場合、 行名=rownames 解像度ごとの結果が格納されている 細胞のバーコード ・ ・ ・ @meta.dataには、細胞の情報がまとまっている
Slide 54: クラスタリングの結果はどこ?-2
クラスタリングの結果はどこ?-2 例 ddseq@ident head(ddseq@ident) FindClusters()の結果は、ddseq@identにも格納される ddseq@identが、tSNE-plotや遺伝子発現量解析おけるクラスター情報として使用される 複数の解像度を指定して解析した場合は、一番最後の解析結果が格納される（ようだ?） 10 cluster (res.1.2) @identは、名前付きのファクター型 解像度0.2の結果で今後の解析を行いたい 例 res02<- as.factor(ddseq@meta.data$res.0.2) #@meta.dataのres
Slide 55: tSNE plot
tSNE plot 例 ddseq <- RunTSNE( object = ddseq, dims.use = 1:6, #クラスターを探した時と同じ次元数が好ましい do.fast = TRUE, perplexity = 50) #tSNEのパラメーター複雑度。大分形が変わる。 TSNEPlot(object = ddseq, pt.size = 2, do.label = TRUE) #tSNE-plotの出力 Perplexity = 20 Perplexity = 50 おおよそ、 tSNEplot上でおおよそ ４つの島、 4つのクラスターに分類
Slide 56: どのクラスターがどの細胞に対応しているのか?
Mixture of 4 cultured cell lines 3 Ovarian Clear Cell Carcinoma (OCCC) Cell Lines OVISE JHOC5 ES2 1 Ovarian Surface Epithelial Cell Line OSE3 どのクラスターがどの細胞に対応しているのか?
Slide 57: Extracting the DEG from bulkRNA-seq data
Extracting the DEG from bulkRNA-seq data DEG: Differentially Expressed Genes バルクRNA-seqのデータから 各細胞で特異的に発現が高い Top10遺伝子を抽出 Log(CPM + 1) 各細胞のマーカー遺伝子を決定 OVISE CALB1 ES2 SERPINB2 JHOC5 MEGEA4 ES2 JHOC5 OVISE
Slide 58: Feature plot (marker gene)
Feature plot (marker gene) SERPINB2 MEGEA4 0 3 2 1 CALB1
Slide 59: DEG in each cluster at single cell resolution
DEG in each cluster at single cell resolution 例 all.markers <- FindAllMarkers( object = ddseq, min.pct = 0.1, thresh.use = 0.1) top15 <- all.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(15, avg_logFC) #%>%: パイプライン演算子 #dplyr package参照 DoHeatmap( object = ddseq, genes.use = top15$gene, use.scaled = TRUE, s
Slide 60: Violin plot (marker gene)
Violin plot (marker gene) Cluster-0 (C0) SERPINB2 CALB1 MEGEA4 ES2? Cluster-1 (C1) OVISE? Expression Value Cluster-2 (C2) JHOC5? Cluster-3 (C3) OSE3? → 別の方法でも確認
Slide 61: Gene correlation between bulkRNA-seq and scRNA-seq
Gene correlation between bulkRNA-seq and scRNA-seq Bulk ES2 50%以上の細胞で検出されている遺伝子 Bulk について、各クラスターにおける JHOC5 平均の発現量を算出 Bulk ddSEQ data OVISE Bulk TOV21G 遺伝子の発現パターンを比較 ddSEQ C1 ddSEQ BulkRNA-seq data C0 上記遺伝子の発現プロファイルのみを使用 ddSEQ （edgeR: TMM → CPM) C2 青: 正の相関係数 ddSEQ 赤: 負の相関係数 C3
Slide 62: Final annotation of each cluster
Final annotation of each cluster Cluster-0 (C0) ES2 ES2 Cluster-1 (C1) OVISE Cluster-2 (C2) JHOC5 Cluster-3 (C3) JHOC5 OSE3 OSE3 4種類の培養細胞を混合した 1細胞RNA-seqのデータから、 OVISE 細胞の種類ごとに分類できた
Slide 63: ここまで解析したddseqを.rds形式で保存
保存 ここまで解析したddseq (Seurat Oblect) を.rds形式で保存 saveRDS(ddseq, “/PATH/TO/YOUR/SAVE/DIRECTORY/****.rds" ) 読み込むときは、 ddseq <- loadRDS(“/PATH/TO/YOUR/SAVE/DIRECTORY/****.rds" )
Slide 64: Gene correlation between ddSEQ and chromium
Gene correlation between ddSEQ and chromium ddSEQ OVISE ddSEQ ES2 同じDroplet-baseの プラットフォーム機器である ddSEQ ddSEQ (Bio-Rad) JHOC5 と Chromium (10x genomics) のデータの比較 10x OVISE 10x ES2 ddSEQのデータと Chromiumのデータには 10x 高い相関性がある JHOC5
Slide 65: 色を変えたい!-1
色を変えたい!-1 よく使用される色のセット 例 library(RColorBrewer) col <- colorRampPalette(brewer.pal(9, “Set1”))#カラーパレットを生成するコマンド res02.col <- col(9)[1:4] #全9色のSet1から最初の4色を選択 scales::show_col(res02.col) #色見本の表示 cluster.02 <- levels(ddseq@ident) #クラスター名を取得 names(res02.col) <- cluster.02 #色に対してクラスター名を与える res02.col #name
Slide 66: 色を変えたい!-2
色を変えたい!-2 例 TSNEPlot(object = ddseq, pt.size = 2, do.label = TRUE, colors.use = res02.col) VlnPlot(object = ddseq, features.plot = c("SERPINB2", "CALB1", "MAGEA4"), y.log = TRUE, cols.use = res02.col) 同じ内容でも引数の名前が異なることがあるので注意 TSNEPlot → color.use VinPlot → cols.use 変更前 変更後 デフォルトの色はR package “ggplot2
Slide 67: まとめ
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix まとめ 多数存在する解析ツールから研究目的に適したツールを選択する 実際に使用してみる、論文での使用頻度 など scRNA-seqの解析ツールの多くはR プログラムスキルがなくともチュートリアルを参照してどうにかなる ので、チュートリアルが充実しているツールがおすすめ 今回使用したSeurat など チュートリアルに従って操作しているうちに、R言語への理解も深まる コマンドでわからないことがあった
Slide 68: ご静聴ありがとうございました!
Preparing Experimental Processing Biological Sequence Expression Design Reads Interpretation Matrix ご静聴ありがとうございました! プログラムスキルの有無にかかわらず、 是非、情報解析にトライしてみてください 楽しく実りあるシングルセルRNA-seq解析ライフを送りましょう