Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Conference Presentation (December 2005)
33 slides from Illumina's conference presentation, December 2005
Slide 1: ヒト細胞アトラス時代の高精度1細胞RNA-seq法
ヒト細胞アトラス時代の高精度1細胞RNA-seq法 二階堂 愛 ♂ (Itoshi NIKAIDO) 東京医科歯科大学 難治疾患研究所 ゲノム機能情報分野 教授 理化学研究所 生命機能科学研究センター バイオインフォマティクス研究開発チーム チームリーダー dritoshi@gmail.com / @dritoshien 1
Slide 2: Agenda
Agenda • なぜ1細胞トランスクリプトーム解析が必要か? (3分) • 高精度&高出力型1細胞RNA-seq: Quartz-Seq2 (15分) • Human Cell Atlas計画とベンチマーキング (15分) • おわりに (2分) 2
Slide 3: 多細胞生物を理解するには、細胞型や状態を計測する必要がある
多細胞生物を理解するには、細胞型や状態を計測する必要がある 細胞型と細胞状態からの生命現象の理解 1細胞生物学によるヒト疾患の理解と制御 多細胞生物 臓器・組織 細胞型 増殖 細胞状態 分化成熟 老化 http://g86.dbcls.jp/~togoriv/ HCA White Paperより • 臓器の振舞は、多様な細胞型や細胞状態の平均値 • 生命科学のあらゆる分野で必要とされる • 細胞型・状態を単離・培養することは困難 3
Slide 4: Agenda
Agenda • なぜ1細胞トランスクリプトーム解析が必要か? (3分) • 高精度&高出力型1細胞RNA-seq: Quartz-Seq2 (15分) • Human Cell Atlas計画とベンチマーキング (15分) • おわりに (2分) 4
Slide 5: RNA-Seq Single-Cell
RNA-Seq >100,000 cells (10 ng Total RNA) ↓ Single-Cell = 0.01-0.1 pg mRNA (1-10 pg total RNA)
Slide 6: 1細胞RNAシーケンス法の基本原理
1細胞RNAシーケンス法の基本原理 • 逆転写・増幅・ライブラリ 作製の3ステップ • 増幅可能な分子への変換と 増幅の2ステップ • 1チューブ/細胞で多段階の複 雑な反応 Sasagawa Y. et al. Genome Biol. 2013 6
Slide 7: Whole-transcriptome Amplification (WTA)
Whole-transcriptome Amplification (WTA) Highest reproducible and sensitive scRNA-seq Full-length scRNA-seq scRNA-seq with linear amplification Quartz-Seq (Sasagawa Y. et al. 2013) Smart-Seq (Ramskold D. 2012), Smart-Seq2 CEL-seq, CEL-seq2 Quartz-Seq2 (Sasagawa Y. et al. 2018) • IVTによる線形増幅 • 逆転写が途中でも
Slide 8: Quartz-Seq2: 高出力・高精度化の原理
Quartz-Seq2: 高出力・高精度化の原理 1. Cell barcode法による簡便化 2. cDNA合成率上昇による分子捕捉改善 3. 逆転写反応のコスト削減 Sasagawa Y. et al. Genome Biol. 2018 8
Slide 9: Quartz-Seq2: 検出遺伝子数と機能数
Quartz-Seq2: 検出遺伝子数と機能数 検出遺伝子数が世界最高 検出遺伝子数が高いと検出機能数が多くなる (14倍) Quartz-Seq2 CEL-seq2 (C1) SCRB-seq MARS-seq Drop-seq Sasagawa Y. et al. Genome Biol. 2018 9
Slide 10: Quartz-Seq2: 検出遺伝子数と機能数
Quartz-Seq2: 検出遺伝子数と機能数 1. 細胞状態の検出 (cell cycle) 2. 希少細胞の検出率 ESC Primitive endoderm (PrE) 00h 12h 24h 48h Dex 1/2000個の希少細胞を99%検出 Sasagawa Y. et al. Genome Biol. 2018 10
Slide 11: Quartz-Seq2: 検出遺伝子数と機能数
Quartz-Seq2: 検出遺伝子数と機能数 1,500 SVF (stromal vascular fraction) cells ・細胞治療に利用されている ・vivo のサンプルのデモ ・細胞サイズが多様 MSC1 • 2種の間葉系幹細胞を発見 • 一方はElastic fiberに関わる遺伝子発 現が高い • 間葉系幹細胞は細胞相互作用のソース MSC2 Sasagawa Y. et al. Genome Biol. 2018 11
Slide 12: Agenda
Agenda • なぜ1細胞トランスクリプトーム解析が必要か? (3分) • 高精度&高出力型1細胞RNA-seq: Quartz-Seq2 (15分) • Human Cell Atlas計画とベンチマーキング (15分) • おわりに (2分) 12
Slide 13: Human Cell Atlas
Human Cell Atlas Om: AREAS OF RESEARCH include 14 ORGAN SYSTEMS 1095 members ~ RESPIRATORY SYSTEM NERVOUS SYSTEM ENDOCRINE SYSTEM URINARY SYSTEM SKELETAL SYSTEM MALE REPRODUCTIVE SYSTEM IMMUNE SYSTEM CARDIOVASCULAR SYSTEM FEMALE REPRODUCTIVE SYSTEM DIGESTIVE SYSTEM INTEGUMENTARY SYSTEM MUSCULAR SYST
Slide 14: COUNTRIES
71 COUNTRIES 1115 INSTITUTES 1827 Members
Slide 15: Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects
Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects 一定の割合で 等分された 凍結された細胞の輸送 混合された細胞 細胞混合液 細胞の用意 1 3 5 9 8 3 5 7 8 9 7 8 9 4 5 ATGCAGATAG AGATAGAAGG CCATGGCGGG インターネットを 1細胞RNA-seqの実施 性能比較 データ解析 シーケンシング 介したデータ転送 (13手法・25研究機関) バルセロナ・スペイン 15
Slide 16: Design of benchmarking study
Design of benchmarking study 13 methods: • Karolinska Institutet, Sweden (Sandberg): Smart-seq2 • MPI Immunology, Germany (Grün): CEL-seq2 • CNAG, Spain (Heyn): MARS-seq • RIKEN, Japan (Nikaido): Quartz-Seq2 • LMU, Germany: gmsSCRB-seq • Biorad/Illumina, US (Martino): ddSEQ • Fluidigm, US (Lynch): C
Slide 17: Template switching vs. IVT vs. PolyA tailing
Template switching vs. IVT vs. PolyA tailing 10 : 2 : 1 17
Slide 18: Number of detected genes
Design of benchmarking study Quartz-Seq2 Number of detected genes Good Chromium v2 Smart-seq2 Bad Mereu E. et al. Nature Biotech 2020 18
Slide 19: なぜQuartz-Seq2が天下一なのか?
なぜQuartz-Seq2が天下一なのか? 分子変換効率を定量化する RNA WTAによる分子変換 シーケンスリード 分子のロス 分子バーコード(UMI): PCR増幅バイアスの低減 RNA 1分子に由来する PCR 1分子に由来する 分子バーコード (UMI: unique molecular identifier) Sasagawa Y. et al. Genome Biol. 2018 19
Slide 20: Quartz-Seq2は分子捕捉率が高い
Quartz-Seq2は分子捕捉率が高い Quartz-Seq2 CEL-seq2 (C1) MARS-seq SCRB-seq Drop-seq Sasagawa Y. et al. Genome Biol. 2018 20
Slide 21: 分子捕捉率からQuartz-Seq2の素過程の効率を類推する
分子捕捉率からQuartz-Seq2の素過程の効率を類推する Sasagawa Y. et al. Genome Biol. 2018 21
Slide 22: Whole-transcriptome Amplification (WTA)
Whole-transcriptome Amplification (WTA) Highest reproducible and sensitive scRNA-seq Full-length scRNA-seq scRNA-seq with linear amplification Quartz-Seq (Sasagawa Y. et al. 2013) Smart-Seq (Ramskold D. 2012), Smart-Seq2 CEL-seq, CEL-seq2 Quartz-Seq2 (Sasagawa Y. et al. 2018) • IVTによる線形増幅 • 逆転写が途中でも
Slide 23: たくさんの細胞からたくさんの検体へ: 1細胞RNAシーケンスは多検体に向かない
たくさんの細胞からたくさんの検体へ: 1細胞RNAシーケンスは多検体に向かない 1,000,000 ? 1. ライブラリは数千万ぐらいは作れそう。技術的 100,000 ハードルは少ない 2. シーケンス量にボトルネックがある。シーケン Chromium (8 x 3,000) サーを開発しないかぎり解消しない Throughput / sample / week / person 10,000 時間: 5-12ヶ月 1,000 コスト: 600万円 Quartz-Seq2 (6, 384) • 6 kit (NovaSeq S4) = (400検体 x 3000細胞 x 50000 ddSe
Slide 24: Agenda
Agenda • なぜ1細胞トランスクリプトーム解析が必要か? (3分) • 高精度&高出力型1細胞RNA-seq: Quartz-Seq2 (15分) • Human Cell Atlas計画とベンチマーキング (15分) • おわりに (2分) 24
Slide 25: Total RNA-sequencingと1細胞トランスクリプトーム
Total RNA-sequencingと1細胞トランスクリプトーム ・1細胞RNA-seqは3’端にリードが偏る ・RNAの約半分は非ポリA配列 AAAAAA RNA RT Primer barcode ・RNA病 1塩基多型疾患の15%はRNA構造異常による It is estimated that up to 15% of all point mutations causing human genetic disease result in an mRNA splicing defect. Krawczak M. et. al. 1992 ・多様な機能性非ポリA RNAが存在 ・3’ U
Slide 26: RamDA-seq: 世界初の1細胞完全長Total RNA-seq法
RamDA-seq: 世界初の1細胞完全長Total RNA-seq法 RT-RamDA 検出遺伝子数 Full-length RNA Hayashi T. et al. Nature Comm. 2018 Patent: WO2016052619A1 26
Slide 27: Single-cell total RNA-sequencingのメディカルサイエンスへの応用
Single-cell total RNA-sequencingのメディカルサイエンスへの応用 1. 多型と発現制御の関連 A. Neo-antigenとがん B. cell typeごとのeQTL Mutation Structural variant of protein Neo-antigen HLA Peptide 2. pre-mRNA/mRNAを標的とした核酸医薬 • 核酸医薬は種特異性が高く動物実験で効能・副作用を評価 スピンラザ できない 乳児型脊髄性筋萎縮症薬 • RNA DBによるオン/オフターゲット効果の評価が最重要 (SMA) 現在のRNA DBは種レベル Single
Slide 28: RamDA-seqの製品化
RamDA-seqの製品化 RamDA-seq試薬キット DNA精製用マグネットプレート • 最新のネオジウム磁石N53を使用 • ウェルとの接着面が低い (3 uLに対応) • 異極配置により強力な磁場を実現 • プラスチック製のため軽量・透明 RamDA-seq用試薬 • 分注ロボットに対応 RT-qPCR用試薬 Fluidigm C1用プログラム Eppendorf epMotion Agilent Bravo 28
Slide 29: Quartz-Seq2の産業応用を目指したスタートアップ
Quartz-Seq2の産業応用を目指したスタートアップ • 再生医療等製品のトランスクリプトームによる評価、開発 • トランスクリプトームとAIを用いた創薬 ライフイノベーションセンター (LIC) @神奈川県川崎市殿町 團野宏樹. PhD. / Co-CEO • 二階堂研出身 • Quartz-Seq2論文の co-first author 福田 雅和. PhD. / Co-CEO • 和光純薬工業株式会社にて、複数の幹 細胞培地を上市 • 製品設計、製造工程や品質試験の立案 の実務を経験 顧問 • 二階堂愛 • 笹川洋平 29
Slide 30: Quartz-Seq2とRamDA-seq
Quartz-Seq2とRamDA-seq Quartz-Seq2: 高精度・高出力1細胞RNA-seq RamDA-seq: 1細胞完全長Total RNA-seq 細胞機能から細胞状態へ 遺伝子のかけらから遺伝子の全体像へ Sasagawa Y. et. al. Genome Biol.. 2013 Sasagawa Y. et. al. Genome Biol.. 2018 Hayashi T. et. al. Nature Comm. 2018 Sasagawa Y. et. al. Adv. Exp. Med. Biol. 2019 Sasagawa Y. et. al. Adv.
Slide 31: Achievements (-2013.4)
Achievements (-2013.4) AAAAAA 1細胞遺伝子発現 RNA代謝 転写制御ネットワーク 細胞分化/相互作用 細胞命運・発生・空間 Quartz-Seq2: highest sensitive and high- ODEGRfinder: De novo transcriptional SCODE: prediction of transcriptional regularity Fate-seq/Fluoro-coding throughput single-cell RNA-seq region finder (Matsumoto T. NARGAB, 2019) n
Slide 32: 我々の研究室に参加しませんか?
我々の研究室に参加しませんか? • 1細胞ゲノム科学研究のハイウェイがある • 学生 • 世界最高の技術 • 東京医科歯科大学 (御茶ノ水) • 1細胞採取やシーケンス、自動分注、データ解析環境 • 入試: 修士 8月, 博士: 9月, 2月 、様々な暗黙知、ドライで解くべきか、ウェットで 解くべきか? • 社会人大学院生も募集 • 人手 << アイディア • 理研インターンシップ (和光・神戸) • 半年から1年ぐらい真剣に研究すれば、論文になりそ • 研究員 うなネタがたくさんある • 随時募集 • キャリアパス: PIやスタートアップ創始者での転出、フ ェローシップや学位の獲得や、技術支
Slide 33: Acknowledgments
Acknowledgments 理研和光 理研神戸 • RIKEN BiT • Yohei Sasagawa • Hiroki Danno • Kaori Tanaka • Tetsutaro Hayashi • Haruka Ozaki • Holger Heyn, CNAG-CRG @dritoshien https://nikaidolab.org/ https://bit.riken.jp/ 敬称略 33