Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (February 2018)
37 slides from Illumina's technical presentation, Feb 28, 2018
Slide 1: RNA-Seqをはじめようライブラリー調製編
RNA-Seqをはじめようライブラリー調製編 絶対に失敗しないライブラリー調製 フィールドアプリケーションサイエンティスト 仲 健太 2018/2/28 © 2016 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cBot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, ForenSeq, Genetic Energy, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, H
Slide 2: RNA-Seqライブラリー調製ワークフロー
RNA-Seqライブラリー調製ワークフロー 1. イルミナのRNA-Seq 用ライブラリー調製キットの紹介 2. RNAの準備 - RNA抽出の注意点 - 必要なRNA量 - ライブラリー調製に適したRNAの品質 3. ライブラリー調製 - TruSeq Stranded mRNA/Total RNA調製方法 4. ライブラリー評価 - ライブラリーの定量と定性 5. シークエンス条件 - シークエンサーインプットDNA量 2
Slide 3: イルミナのRNA-Seq用ライブラリー調製キットの紹介
イルミナのRNA-Seq用ライブラリー調製キットの紹介 TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit mRNAの解析 RNA-Seqのスタンダード！ TruSeq RNA Access/ TruSight Pan- ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織由来 Cancer Library Prep Kit の分解したRNAでも解析可能（対象生物はヒト） TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero H/M/R rRNA（細胞質）を除去し、mRNAとpolyA を持たないRNAを解析。 Goldではミトコン TruSeq Strande
Slide 4: ライブラリー調製キット紹介
ライブラリー調製キット紹介 - ライブラリー調製キット構成品単位変更 旧構成：キット内にライブラリー試薬とインデックスボックスが含 まれる。 ライブラリー調製試薬 インデックス ・cDNA Synthesis PCR Box ・Box1 ・Index Box ・Box2 新構成：ライブラリー調製試薬とインデックスボックスを組み合わ せる。 ライブラリー調製試薬 インデックス • サンプル数に応じてご選択ください • インデックスの数、種類に応じてご • 48 samples / 96 samples 選択ください 4
Slide 5: ライブラリー調製試薬 - TruSeq Stranded mRNA Library Prep
ライブラリー調製試薬 - TruSeq Stranded mRNA Library Prep ライブラリー調製試薬 インデックス • サンプル数に応じてご選択ください • インデックスの数、種類に応じてご 選択ください ライブラリー調製試薬 型番 製品名 価格 / キット 20020594 TruSeq Stranded mRNA Library Prep (48 Samples) 397,000円 20020595 TruSeq Stranded mRNA Library Prep (96 Samples) 794,000円 価格は2018年10月現在の価格です。 5
Slide 6: ライブラリー調製試薬 - TruSeq Stranded Total RNA Library Prep
ライブラリー調製試薬 - TruSeq Stranded Total RNA Library Prep ライブラリー調製試薬 インデックス • Ribo-Zeroの種類およびサンプル数 • インデックスの数、種類に応じてご に応じてご選択ください 選択ください ライブラリー調製試薬 型番 製品名 価格 / キット TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Human/Mouse/Rat 20020596 989,000円 (48 Samples) TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Human/Mouse/Rat 2
Slide 7: インデックス
インデックス ライブラリー調製試薬 インデックス • サンプル数に応じてご選択ください • インデックスの数、種類に応じてご 選択ください インデックス 型番 製品名 価格 / キット 20020492 TruSeq RNA Single Indexes Set A (12 Indexes, 48 Samples) 42,000円 20020493 TruSeq RNA Single Indexes Set B (12 Indexes, 48 Samples) 42,000円 20019792 TruSeq RNA CD Index Plate (96 Indexes, 96 Samples)
Slide 8: ライブラリー調製 必要準備品 - 試薬消耗品
ライブラリー調製 必要準備品 - 試薬消耗品 製品名 製造販売元 型番 容量 1サンプルあたり必要量 反応サンプル数 BC-A63880 5 ml 20 Beckman Agencourt AMPure XP kit 232 ul Coulter BC-A63881 60 ml 250 18064-014 10,000 U 50 SuperScript II Reverse Thermo 200 U Transcriptase* Fisher 18064-071 4x 10,000U 200 Agilent DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 25 Chip 1 Ch
Slide 9: ライブラリー調製 必要準備品 - 機器
ライブラリー調製 必要準備品 - 機器 製品名 製造販売元 型番 Agilent 2100 Bioanalyzer （もしくは同等品） Agilent G2940CA Qubit Fluorometer（もしくは同等品） Thermo Fisher Q32866 サーマルサイクラ―（ヒートリッド付） メーカー指定なし 96ウェル専用マグネットスタンド メーカー指定なし 96ウェル深底プレート （MIDIプレート） Thermo Fisher AB-0859 これらの機器は多検 96ウェルプレート メーカー指定なし 体同時処理を想定し た準備品。少数検体 インキュベーター SciGene 105
Slide 10: 代用可能な機器準備品
代用可能な機器準備品 少数検体の場合 ・96 wellプレート、96well深底プレート（MIDIプレート）はなくてもPCR チューブ、1.5 ml チューブでそれぞれ代用可能。 マグネットスタンドは、以下の製品が使いやすい。 日本ジェネティクス Cat# FG-SSMAG2 NGS MagnaStand （YS-Model) 8Ch×0.2ml PCRチューブ用 ・プレートシェーカーによる懸濁はピペッターでも可能。 よくビーズ・試薬を懸濁すること ＊国内での作業実績をもとにしております。正式なサポート内容については、Reference Guide (#1000000040498)をご参照くだ
Slide 11: RNA-Seqライブラリー調製ワークフロー
RNA-Seqライブラリー調製ワークフロー 1. イルミナRNA-Seq 用ライブラリー調製キット紹介 2. RNAの準備 - RNA抽出時の注意点 - ライブラリー調製に必要なRNA量 - ライブラリー調製に適したRNAの品質 3. ライブラリー調製 - TruSeq Stranded mRNA/Total RNA調製方法 4. ライブラリー評価 - ライブラリーの定量と定性 5. シークエンス条件 - シークエンサーインプットDNA量 11
Slide 12: RNAの準備 - RNA抽出時の注意点
RNAの準備 - RNA抽出時の注意点 Reference Guide (part#1000000040498)にはRNA抽出の指定の方法、キットは ない。 ＜抽出キット例＞ ・RNeasy Mini Kit (QIAGEN) ・NucleoSpin (Takara bio) RNA抽出時、DNase処理を実施。 - 残存DNAは逆転写酵素の基質となり、ライブラリー化されてしまう。 キャリアは使用しない。 - グリコーゲン、ヘパリンは酵素活性を阻害します。yeast tRNAはライブラ リーの基質となります。 抽出したRNAは吸光度測定し、精製度を確認しましょう。 - 260/
Slide 13: RNAの準備 - ライブラリー調製に必要なRNA量
RNAの準備 - ライブラリー調製に必要なRNA量 TruSeq Stranded mRNAの場合 - 2~80 ng/µl Total RNAを50 µl（総量：100 ng ~ 4 µg）、もしくは0.2~8 ng/µl 精製済mRNAを50 µl （総量：10 ng ~ 400 ng） 。 TruSeq Stranded Total RNAの場合 - 2~20 ng/µlのTotal RNAを50 µl （総量：100 ng ~ 1 µg） 。 RNA定量方法の指定はない。 - Qubit、PicoGreen、NanoDropなどご使用ください。 13
Slide 14: RNAの準備 - ライブラリー調製に適したRNAの品質
RNAの準備 - ライブラリー調製に適したRNAの品質 Agilent 2100 Bioanalyzer、Tape Station、もしくは同等品を使用し、RIN値（RNA Integrity Number）でRNAの分解度を確認。 評価は1~10の数値（満点10）。 Bioanalyzerでの理想的なTotal RNA泳動図 TruSeq Stranded mRNA：RIN値≧8。 TruSeq Stranded Total RNA：FFPEなど分解されているRNAでも解析。 - Reference Guide (part#1000000040498)にRIN値記載はございませんが、
Slide 15: RNA-Seqライブラリー調製ワークフロー
RNA-Seqライブラリー調製ワークフロー 1. イルミナRNA-Seq 用ライブラリー調製キット紹介 2. RNAの準備 - RNA抽出時の注意点 - ライブラリー調製に必要なRNA量 - ライブラリー調製に適したRNAの品質 3. ライブラリー調製 - TruSeq Stranded mRNA/Total RNA調製方法 4. ライブラリー評価 - ライブラリーの定量と定性 5. シークエンス条件 - シークエンサーインプットDNA量 15
Slide 16: TruSeq Stranded mRNAワークフロー
mRNA TruSeq Stranded mRNAワークフロー RNA Step3：3’末端にdATP付加 Step1：mRNA精製と断片化 Step2：cDNA合成 Step4：アダプターライゲーション Step2：平滑化とリン酸化 Step5：PCR増幅 16
Slide 17: TruSeq Stranded Total RNAワークフロー
Total RNA TruSeq Stranded Total RNAワークフロー H/M/R Gold Globin Plant Ribosomal RNA RNA rRNA probe Step3：3’末端にdATP付加 rRNA depletion, fragmentation and random priming Step1：rRNA除去と断片化 Step2：cDNA合成 Step4：アダプターライゲーション Step2：平滑化とリン酸化 Step5：PCR増幅 17
Slide 18: TruSeq Stranded mRNAとTotal RNAワークフローの違い
TruSeq Stranded mRNAとTotal RNAワークフローの違い TruSeq Stranded mRNA TruSeq Stranded Total RNA Step1 mRNA精製 rRNA除去 Step2 cDNA合成,平滑化とリン酸化 Step3 3’末端のdATP付加 Step4 アダプターライゲーション Step5 PCR増幅 18
Slide 19: ストランド情報を維持
ストランド情報を維持 - Second Strand cDNA合成時にdUTPを使用 First Strand cDNA Second Strand cDNA PCR増幅で使用するPolymeraseはdUTPを鋳型にできず、 Second Strand cDNA鎖は 増幅されず、First Strand cDNAのみ合成される。 19
Slide 20: Step1：mRNA精製と断片化①
mRNA Step1：mRNA精製と断片化① ① Total RNA (2~80 ng/µl ) 50 µl RNA Purification Beads 50 µl Total 100 µl プログラム名：mRNA Denaturation Lid 温度：100℃ 65℃, 5分 4℃, hold 室温, 5分 ② マグネットスタンドに置き、5 分。上清除去。 ビーズにmRNAが結合しているので回収するのはビーズです ③ 200 µl Beads Wash Buffer(BWB)を加え、ビーズウォッシュ。 リボソームRNAや非メッセンジャーRNAを除去 ④ 50 µl Elution Buf
Slide 21: Step1：mRNA精製と断片化②
mRNA Step1：mRNA精製と断片化② ⑤ ④に50 µl Beads Binding Buffer(BBB)を加える。 室温, 5 分。 ⑥ マグネットスタンドに置き、5 分。上清除去。 ⑦ 200 µl BWBを加え、ビーズウォッシュ。 このステップで1度剥がしたmRNAを再度ビーズに結合させること で1回目のwashで除ききれなかった非メッセンジャーRNAを除去 します ⑧ 19.5 µl Fragment Prime Finish Mix(FPF)を加える。 FPFには1st ストランドcDNA合成用ランダムプライマー、2価陽 イオンが含まれています ⑨ プログラム名：Eluti
Slide 22: Step1：rRNA除去と断片化①
Total RNA Step1：rRNA除去と断片化① H/M/R Gold ① Total RNA (0.1~1 µg) 10 µl Globin Plant RNA Binding Buffer 5 µl rRNA Removal Mix 5 µl Total 20 µl プログラム名：rRNA Denaturation 68℃, 5 分 Lid 温度：100℃ →4℃, holdはしない！ 室温, 1 分 ② ＜次の実験準備＞ 良く撹拌したrRNA Removal Bead(RRB)を予め準備した、新しいプレートに 35 µl分注。 →①の反応チューブ直接に入れない！ Denatured
Slide 23: Step1：rRNA除去と断片化②
Total RNA Step1：rRNA除去と断片化② H/M/R Gold ⑤ マグネットスタンドに置き、上清回収。 Globin Plant ビーズにはrRNAが結合しているので回収するのは上清です ⑥ ⑤で回収した上清を再度マグネットスタンドに静置し、上清回収。 →しっかりとビーズを除くことが重要！ ⑦ RNAClean XP（AMPure XPのRNA用）を用いて、RNAを精製。 ・FFPEなど分解度の激しいサンプルを使用する場合、193 µl加える 小さいサイズのRNAも回収します。 ・上記以外の場合は99 µl加える。→添加量が違うことに注意！ ⑧ 11 µl Elution Bu
Slide 24: Step2：cDNA合成（First Strand cDNA）
mRNA Total RNA Step2：cDNA合成 H/M/R Gold （First Strand cDNA） Globin Plant ① 17 µl 断片化されたmRNA / rRNA除去RNA ② 以下のPremix 8 µlを加えます（反応液の総量は25 µl）。 Reagent 1 rxn アクチノマインD： ゲノムDNAからの逆転写反応を First Strand Synthesis Act D Mix 9 µl 抑制する目的で加えます。発が SuperScriptll or Protoscript II 1 µl ん性があるので取扱いにはご注 Total Volume 10
Slide 25: Step2：cDNA合成（Second Strand cDNA）
mRNA Total RNA Step2：cDNA合成 H/M/R Gold （Second Strand cDNA） Globin Plant ④ 25 µl 反応溶液 ⑤ 5 µl Resuspention Bufferを加える。 Resuspention Bufferは1回目の融解時、よく撹拌した後、コンタミ対策 のため小分けしましょう ⑥ 20 µl Second Strand Marking Mix(SMM)を加える。 SMMにはpolymeraseやNTPsが含まれています。不要な凍結融解を低 減するため1回目の融解時、よく撹拌した後、小分けにしましょう 16℃, 1 hour ヒ
Slide 26: Step3：3’末端にdATP付加
mRNA Total RNA Step3：3’末端にdATP付加 H/M/R Gold A-Tailing MixにはKlenow(3’-5’ exo-)が Globin Plant ① 回収したds cDNA 15 µl 含まれております。不要な凍結融解 Resuspention Buffer 2.5 µl を低減するため1回目の融解時、撹拌 A-Tailing Mix (ATL) 12.5 µl した後、小分けしましょう Total 30 µl 撹拌にはVortexは避けましょう プログラム名：ATAIL70 Lid 温度：100℃ 37℃, 30 分 70℃, 5 分 精製なしで、次のス
Slide 27: Step4：アダプターライゲーション
mRNA Total RNA Step4：アダプターライゲーション H/M/R Gold ① アデニル化ds cDNA 30 µl Globin Plant Resuspention Buffer 2.5 µl Ligation Mix 2.5 µl Total 35 µl Index Adapterは4回以上、凍結融解しな ② 2.5 µl Index adapterを加える。 いことが推奨。それ以上、凍結融解を繰 30℃, 10 分 Lid 温度：100℃ り返す場合は分注しましょう ③ 5 µl Stop Ligation Buffer(STL)を加え、反応停止。 ④ 42 µl AMP
Slide 28: Step5：PCR増幅
mRNA Total RNA Step5：PCR増幅 H/M/R Gold ① アダプターライゲーションds cDNA 20 µl Globin Plant PCR Primer Cocktail(PPC) 5 µl PCR Master Mix(PMM) 25 µl Total 50 µl プログラム名：PCR Lid 温度：100℃ 98℃, 30 秒 98℃, 10 秒 60℃, 30 秒 x15 PCRバイアス、PCRデュプリケートを 72℃, 30 秒 防ぐためにPCRサイクル数の増やすのは 72℃, 5 分 避けましょう 4℃, hold ② AMPure XPを加え、精製。 ・シ
Slide 29: AMPure XP / RNAClean XP
AMPure XP / RNAClean XP AMPure XP にはポリエチレングリコール（PEG）、NaCl、2価陽イオン、磁性ビー ズ（SPRIビーズ）等が含まれています。 ＜核酸精製＞ ポリエチレングリコール沈殿と同様な原理でDNAを精製。 図．AMPure XP Beadsプロトコール https://ls.beckmancoulter.co.jp/products/genomics/ampure-xp 1. 2. 核酸を含む反応溶液にAMPure XPを加える。 3. ポリエチレングリコールによってDNAが沈殿し、ビーズに結合。マグネット スタンドに置き、上清除去。 4. EtO
Slide 30: AMPure XP / RNAClean XP
AMPure XP / RNAClean XP ビーズとDNAの結合にはポリエチレングリコールと塩濃度に依存。 ＜サイズ選択＞ AMPure XPの添加量によって回収される核酸のサイズが変わります。 目的のDNAサイズを回収するためにはAMPure XPと核酸溶液の体積比が重要。 図．Size Selection “GA Boot Camp” https://www.broadinstitute.org/files/shared/illuminavids/SamplePrepSlides.pdf 30
Slide 31: AMPure XP / RNAClean XP - ワークフロー留意点
mRNA Total RNA AMPure XP / RNAClean XP H/M/R Gold - ワーフフロー留意点 Globin Plant TruSeq Stranded mRNA / Total RNA sample Prep kit Reference Guide AMPure XPワークフロー 1. DNA溶液にReference Guide記載の量のAMPure XPを加え、ピペッティング。 静置、15 分。 AMPure XPは使用する30分以上前に室温 に出しておき、使用する直前にはボルテ 2. マグネットスタンドに置き、上清除去。 ックスでよく撹拌してください。 AMP
Slide 32: RNA-Seqライブラリー調製ワークフロー
RNA-Seqライブラリー調製ワークフロー 1. イルミナRNA-Seq 用ライブラリー調製キット紹介 2. RNAの準備 - RNA抽出時の注意点 - ライブラリー調製に必要なRNA量 - ライブラリー調製に適したRNAの品質 3. ライブラリー調製 - TruSeq Stranded mRNA/Total RNA調製方法 4. ライブラリー評価 - ライブラリーの定量と定性 5. シークエンス条件 - シークエンサーインプットDNA量 32
Slide 33: ライブラリー評価 - ライブラリーの定量と定性
ライブラリー評価 - ライブラリーの定量と定性 ＜定量方法＞ ・ライブラリー調製初めての方、不慣れな方はQubit、qPCR、Bioanalyser（もしく は同等品）3つの手法で実施することが推奨。手法間で濃度に大きな相違がないこ とを確認して下さい。 ・期待される収量は経験的に数十ng/µlであることが多いです。 ＜定性方法＞ ・ライブラリー1 µl使用し、 Agilent 2100 Bioanalyzer （DNA1000チップ）等でサイ ズ評価。 ・260 bp付近にピークがみられます。 Bioanalyzerでの理想的なライブラリー泳動図 33
Slide 34: RNA-Seqライブラリー調製ワークフロー
RNA-Seqライブラリー調製ワークフロー 1. イルミナRNA-Seq 用ライブラリー調製キット紹介 2. RNAの準備 - RNA抽出時の注意点 - ライブラリー調製に必要なRNA量 - ライブラリー調製に適したRNAの品質 3. ライブラリー調製 - TruSeq Stranded mRNA/Total RNA調製方法 4. ライブラリー評価 - ライブラリーの定量と定性 5. シークエンス条件 - シークエンサーインプットDNA量 34
Slide 35: シークエンス条件 - ライブラリーインプットDNA量
シークエンス条件 - ライブラリーインプットDNA量 RNA-Seqライブラリーはインサート長が150-220 bpになり、クラスターができやす いです。 はじめてRNA-Seqをする場合、シークエンサーへのインプットライブラりー量は Support Bulletin記載（500 bpのライブラリーを想定）の濃度よりも少し控えめ （x0.7–x0.8）にしましょう。 RNA-Seq Platform インプット濃度 至適クラスター密度 ライブラリーインプット濃度 HiSeq 2000/2500 High OutPut v3 12.0 pM 750 - 850K clusters/mm2 8.5
Slide 36: まとめ
まとめ 必ずプロトコールに沿って、実験を行って下さい。 - Input RNAの量、分解度 - rRNA除去のステップ Resuspention Buffer、 Second Strand Marking Mix(SMM)、A-Tailing Mix (ATL) は一回目の融解時、チューブに小分けしましょう。 AMPure XPの取り扱いには注意しましょう。 シークエンサーへのサンプル添加量は少し控えめにしましょう。 36
Slide 37: トラブルシュート
トラブルシュート ライブラリー収量が極端に少ない。 →スタートRNA が100 ng 以上であることを再度ご確認ください。 →RIN値が基準値以上であることを確認して下さい。 →AMPure XP時、過度の風乾の可能性があります。 →凍結・融解の繰り返しによる酵素の失活 120 bp付近にライブラリーとは別のピークが見られる。 →アダプター同士の連結物です。ライブラリーと等量のAMPure XP で精製して下さい。 期待したライブラリーサイズとは別の位置に低いピークが見られる。 →AMPure XPを正確な量添加して下さい。 期待したクラスター密度よりも極端に少ない、あるいは多