Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN

Illumina — Technical Presentation (April 2018)

84 slides from Illumina's technical presentation, Apr 25, 2018

  1. Slide 1: イルミナでAmpliSeqパネル解析をはじめよう 製品紹介とライブラリー調製編

    イルミナウェビナー 「イルミナでAmpliSeqパネル解析をはじめよう」シリーズ -製品紹介とライブラリー調製編- 西濱 啓一郎、渡辺 瑞樹 サービス・サポート部 | April/25/2018 © 2017 Illumina, Inc. All rights reserved. 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  2. Slide 2: Thermo Fisher社Ion AmpliSeqテクノロジーがイルミナで使用可能に

    2018年1月8日 カリフォルニア州カールスバッド、サンディエゴ--（BUSINESS WIRE）-- Thermo Fisher ScientificおよびIllumina, Inc. は本日、イルミナの次世代シー ケンサー（NGS）プラットフォームを用いた科学的研究を行う研究者にイルミナがIon AmpliSeq テクノロジーを販売することを可能にする商業契約を締結したと発表しました。 最高クラスのアンプリコンテクノロジーは、多種多様な研究分野に応用できるため、微量 のサンプルからDNAやRNAを解析するのに非常に効果的です。 今回の合意により、Thermo Fisherはイルミナに研究用

  3. Slide 3: 新登場！ AmpliSeq for Illumina

    新登場！ AmpliSeq for Illumina 完全なターゲットリシーケンシングソリューション AmpliSeq for Illumina コンテンツ 試薬 シーケンス 解析 ● カタログパネル ● ライブラリー調製試薬 ● ベンチトップに最適 ● ローカルおよびクラ ● 受注生産パネル ● インデックス ● すべてのスループッ ウドベースの解析 – コミュニティパネル トに対応  Local Run Manager – カスタムパネル ● 新製品iSeqにも対応  BaseSpace Sequence Hub  BaseSpace Variant Interpreter  Am

  4. Slide 4: 今回のウェビナーの流れ

    今回のウェビナーの流れ ● AmpliSeq概要 - ワークフローの説明、製品紹介、パネルの選択からキットの購入まで ● 実験準備 - 実験環境、準備品、実験サンプル（DNA、RNA） ● 実験ワークフロー - 実験手順、注意事項、成功させるためのポイント 本ウェビナーで使用したスライドと録画は、およそ一週間後に 弊社HPに過去のウェビナーとしてアップロードされます。 https://jp.illumina.com/events/webinar.html 4 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  5. Slide 5: イルミナウェビナー AmpliSeqパネル解析シリーズのご案内

    イルミナウェビナー 「イルミナでAmpliSeqパネル 解析をはじめよう」シリーズのご案内 AmpliSeqの製品紹介 AmpliSeqの AmpliSeqの ライブラリー調製 情報解析 カスタムデザイン 4月25日 5月30日 6月末予定 • AmpliSeq製品 • AmpliSeqの • AmpliSeqの 群の紹介の他、 情報解析の流 カスタムデザ ライブラリー調 れから出力結 インの手順を、 製を成功させる 果まで、がん 実際に遺伝子 ためのワークフ パネルを例に やホットス ローと実験時の 紹介します。 ポットなどを Tipsをお伝えし 例に紹介しま 5 ます。 す。

  6. Slide 6: AmpliSeq for Illumina概要

    AmpliSeq for Illumina概要 6 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  7. Slide 7: AmpliSeq for Illuminaとは？

    AmpliSeq for Illuminaとは？ ● PCRベースのアンプリコンシーケンス ● インプット: DNA、RNA（パネルによる） ● 解析アプリケーション：変異解析、発現解析 ● 簡単な実験作業で、イルミナシーケンサー用ライブラリーを調製でき、 確実なデータが得られる マルチプレックスPCR イルミナシーケンサー用ライブラリー （AmpliSeqテクノロジー） ①Flowcellとのハイブリ ②シーケンスプライマーのハイブリ ③シーケンスされるDNA ④Index (サンプル区別のためのバーコード） ① ④ ② ③ ② ④ ① マルチプレックスPCRでターゲット領域を増やし、サンプ

  8. Slide 8: AmpliSeq for Illumina ポートフォリオ

    AmpliSeq for Illumina ポートフォリオ パネルオプション カタログパネル コミュニティパネル カスタムパネル 8 30 合成済 受注生産 受注生産 便利な小さなサンプルサイズ デザインが決まっている製品 お客様がデザインする製品 > 90% カバレッジ均一性1 <96 アンプリコン: ~750反応 <96 アンプリコン: ~750反応 > 90% オンターゲット1 >96 アンプリコン: ~3000反応 >96 アンプリコン: ~3000反応 1 パネルによって多少異なります パネルの性能は、保証外 パネルの性能は、保証外 Comprehensive Cancer 16 遺

  9. Slide 9: カタログパネル概要

    カタログパネル概要 サンプル カタログパネル ターゲット の種類 Comprehensive 既知のがん関連409遺伝子の体細胞変異 Cancer 既知がん関連50遺伝子のホットスポット領域の Cancer Hotspot v2 体細胞変異 DNA Exome 59Mbのエクソン領域の生殖細胞系列変異 BRCA1とBRCA2の全エクソン領域および隣接イン BRCA トロン配列の体細胞変異と生殖細胞系列変異 腫瘍免疫系相互作用に関与する395遺伝子における Immune Response がんバイオマーカーの発現 RNA Transcriptome Human 20,000個を超えるヒトRefS

  10. Slide 10: AmpliSeq for Illumina ワークフロー

    AmpliSeq for Illumina ワークフロー 5月のウェビナーで説明 1日目 2日目 3日目 ライブラリー調製 シーケンス 解析 5 ～ 7時間 約17 ～ 32時間* • ローカルおよびクラウ • ハンズオン1.5時間 • イルミナデスクトップシー ドベースの解析 • 10ステップ ケンサーに対応  Local Run Manager • 試薬充填済みカートリッジ  BaseSpace Sequence • タッチパネル式操作 Hub • 固定パネルでは 2x151 bp  BaseSpace Variant *シーケンサーごとに異なる Interpreter 10 製品の

  11. Slide 11: キットの選択

    キットの選択 11 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  12. Slide 12: AmpliSeq for Illuminaで購入いただく3つの試薬

    AmpliSeq for Illuminaで購入いただく3つの試薬 ①パネル、②Library PLUS、③インデックス ＋ ＋ ①パネル ②Library PLUS 試薬 ③インデックス 以下より選択: 3種類をご用意: 現在: ● カタログパネル ● 24 反応（1 箱） AmpliSeq CD1 Indexes Set − 24 反応（1 箱） ● 96 反応（1 箱） A for Illumina (96 インデッ − ただし、Exomeは8反応 ● 384 反応（4 箱） クス, 96 サンプル) 1 箱、 プレートタイプ ● コミュニティ & カスタム − <96 アンプリコン,

  13. Slide 13: AmpliSeq for Illuminaケミストリー

    AmpliSeq for Illuminaケミストリー ①AmpliSeq Panel パネルによって異なる ターゲット領域の PCR用のプライマー セット ②Library PLUS 反応試薬 共通 ③Index plate インデックス 共通 1–100 ng インプット 合計5 – 7 時間 ハンズオン1.5 時間 推奨 – 10ng / プール 13 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  14. Slide 14: ①パネルの選択

    ① パネルの選択  AmpliSeqパネル製品から選択する - AmpliSeq for Illuminaウェブサイトを参照ください https://jp.illumina.com/products/by-brand/ampliseq.html  遺伝子名から検索する - Gene Panel Finderをご使用ください https://jp.illumina.com/products/selection-tools/gene-panel-finder.html  カスタムでデザインする - DesignStudio*をご使用ください https://designstudio.illu

  15. Slide 15: ① AmpliSeq for Illuminaウェブサイト

    ① AmpliSeq for Illuminaウェブサイト https://jp.illumina.com/products/by-brand/ampliseq.html リンクをクリックす ると詳細をご確認い ただけます 15 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  16. Slide 16: ① AmpliSeq for Illuminaウェブサイト（カタログパネル）

    ① AmpliSeq for Illuminaウェブサイト（カタログパネル） https://jp.illumina.com/products/by-brand/ampliseq.html クリック 下にスクロール Data Sheet マニュアルなど 16 遺伝子リスト 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  17. Slide 17: Cancer Hotspot Panel v2（Data Sheetより）

    Cancer Hotspot Panel v2（Data Sheetより） ターゲット： 既知がん関連50遺伝子のホットスポット領域の体細胞変異 https://jp.illumina.com/content/dam/illumina- marketing/apac/japan/documents/products/datasheets/ampliseq-for-illumina-cancer-hotspot-panel- data-sheet-770-2017-026-jpn.pdf 17 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  18. Slide 18: ① Gene Panel & Array Finder

    ① Gene Panel & Array Finder https://jp.illumina.com/products/selection-tools/gene-panel-finder.html 検索する遺伝子名を 入力する 18

  19. Slide 19: ① Gene Panel & Array Finder

    ① Gene Panel & Array Finder https://jp.illumina.com/products/selection-tools/gene-panel-finder.html 検索した遺伝子を含むイルミナ 製品が表示される （AmpliSeq以外も含む） 19 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  20. Slide 20: ① DesignStudio

    ① DesignStudio https://designstudio.illumina.com/ ● サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社と同じ設計アルゴリズム ● AmpliSeq DNAカスタムは販売中 ● AmpliSeq RNA カスタムは今年の後半販売開始（現在、RNAのカスタムは TruSeq targeted RNAで対応） ● 現在の設計対象生物種（12種）  ヒト、マウス、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、イヌ、チンパンジー、ダイ ズ、トウモロコシ、トマト、イネ ● 上記以外のカスタムゲノムは、今年後半から対応 ● 価格は、1アンプリコンあたり1,080円 20 製

  21. Slide 21: ① DesignStudio

    ① DesignStudio https://designstudio.illumina.com/  テクニカルサポートでカスタム設計をサポートいたします  6月に開催するウェビナーで手順詳細を説明いたします 21 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  22. Slide 22: AmpliSeq for Illuminaケミストリー

    AmpliSeq for Illuminaケミストリー サンプル数ではなく、 プール数に基づいた 反応数で計算します ①AmpliSeq Panel パネルによって異なる ターゲット領域の PCR用のプライマー セット ②Library PLUS 反応試薬 共通 ③Index plate インデックス 共通 1–100 ng インプット 合計5 – 7 時間 ハンズオン1.5 時間 推奨 – 10ng / プール 22 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  23. Slide 23: ② 1サンプルについて2プールで反応が基本

    ② 1サンプルについて 2プール（2チューブ）で反応が基本 プール1 プール2 ただし、Hot Spot だけなら 1 プールで可能  1プール3,072アンプリコンまで  アンプリコン数が多くなるとプール を分ける必要がある  Exome では 12プール この赤の Hot Spot だけ解析したい （293,903アンプリコン）  Library PLUS の1反応分の試薬は2プールまで対応します  パネルが 4 プールの場合、Library PLUS は2反応分必要です  1 プールの時も、Library PLUS は1反応必要です 23 製品の使用目的は研究に限定されます。

  24. Slide 24: ② パネル製品のインプットおよびプール数

    ② パネル製品のインプットおよびプール数 インプット プロトコル Panel 1 kit Library Panel 1 kit に必要な 推奨量 FFPE プール/ PLUS試薬 AmpliSeq Panel 生物種 あたりの Library 例外 (ng)* 対応 サンプル 反応数/ サンプル数 PLUS試薬 サンプル 反応数 Comprehensive Cancer 40 〇 ヒト 4 2 24 48 Cancer HotSpot v2 10 〇 ヒト 1 1 24 24 Exome 50-100 ヒト 12 3 8 24 DNA BRCA 20 〇 ヒト 2 1 24 24 カスタム

  25. Slide 25: ② Library PLUS 試薬

    ② Library PLUS 試薬  Library PLUS 試薬には24、96、384反応の3種類のキットがある  使用するパネル製品によって、サンプルあたりに必要なLibrary PLUS 試薬の反応数が異なる  Library PLUS試薬は、Exome以外は1反応で2プールまで可能 （ただし、1プールでも1反応分使用する）  DNAとRNAの両方を使用するパネルでは、DNAおよびRNA別々に 反応するため、Library PLUS試薬もそれぞれで必要になる 実験にあたっては、必ず各パネル製品のマニュアル（Reference Guide） を確認してください 25 製品の使用目

  26. Slide 26: AmpliSeq for Illuminaケミストリー

    AmpliSeq for Illuminaケミストリー ①AmpliSeq Panel パネルによって異なる ターゲット領域の PCR用のプライマー セット ②Library PLUS 反応試薬 共通 ③Index plate インデックス 共通 1–100 ng インプット 合計5 – 7 時間 ハンズオン1.5 時間 推奨 – 10ng / プール 26 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  27. Slide 27: ③ インデックス

    ③ インデックス  Index Plateは、AmpliSeq CD* Indexes Set A for Illumina（96 Indexes, 96 Samples）の1種類  CD: Combinational Dual（12種類のIndex 1 [i7] と8種類のIndex 2 [i5] の組み合わせで96種類の インデックス）  プレートタイプで、i7とi5がプレミックスされて いる  1ランあたりのサンプル数が少ない場合は、使用 するインデックスの組み合わせに注意  Index Adapter Pooling Guideを参照 https://support.illu

  28. Slide 28: AmpliSeq for Illumina ワークフロー

    AmpliSeq for Illumina ワークフロー 1日目 2日目 3日目 ライブラリー調製 シーケンス 解析 5 ～ 7時間 約17 ～ 32時間* • ローカルおよびクラウ • ハンズオン1.5時間 • イルミナデスクトップシー ドベースの解析 • 10ステップ ケンサーに対応  Local Run Manager • 試薬充填済みカートリッジ  BaseSpace Sequence • タッチパネル式操作 Hub • 固定パネルでは 2x151 bp  BaseSpace Variant *シーケンサーごとに異なる Interpreter 28 製品の使用目的は研究に限定され

  29. Slide 29: 各パネル製品におけるサンプルスループット

    各パネル製品におけるサンプルスループット ～推奨カバレッジに基づくランあたりのサンプル数～ ● Exome (8 サンプル) ● Comprehensive Cancer (12サンプル) ● Transcriptome (40サンプル) ● Comprehensive v3 (48サンプル) MiniSeq MiSeq NextSeq 装置のスループット ● Immune Response (24 サンプル) ● Focus パネル (48 サンプル) ● BRCA 体細胞 (80 サンプル) ● Cancer Hotspot (96 サンプル) ● BRCA 生殖細胞系列 (96 サンプル

  30. Slide 30: 各パネル製品におけるサンプルスループット

    各パネル製品におけるサンプルスループット Data Sheetをご参照ください Cancer Hotspot Panel v2の例 https://jp.illumina.com/content/dam/illumina- marketing/apac/japan/documents/products/datasheets/ampliseq-for-illumina-cancer- hotspot-panel-data-sheet-770-2017-026-jpn.pdf 30 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  31. Slide 31: コスト試算例： Cancer HotSpot v2

    コスト試算例： Cancer HotSpot v2（DNA 24サンプル） プロトコル Library PLUS Panel 1 kitに必要 プール Panel 1 kitあた AmpliSeq Panel 試薬反応数 なLibrary PLUS /サンプル りのサンプル数 /サンプル 試薬反応数 Cancer HotSpot v2 1 1 24 24 24サンプル実 希望販売 サンプルあたり カタログ番号 製品名 施に必要な 価格（円） の価格（円） キット数 AmpliSeq Cancer Hotspot 200191161 78,000 1 3,250 Panel v2 for Ill

  32. Slide 32: コスト試算例： Focus Panel

    コスト試算例： Focus Panel （24サンプルについて、DNAとRNAの両方実験） プロトコル Library PLUS Panel 1 kitに必要 プール Panel 1 kitあた AmpliSeq Panel 試薬反応数 なLibrary PLUS /サンプル りのサンプル数 /サンプル 試薬反応数 1 DNA 1 DNA 24 DNA Focus 48 1 RNA 1 RNA +24 RNA 24サンプル実 希望販売 サンプルあたり カタログ番号 製品名 施に必要な 価格（円） の価格（円） キット数 AmpliSeq Focus Panel for 20019164 372

  33. Slide 33: コスト試算例： Comprehensive Panel v3

    コスト試算例： Comprehensive Panel v3 （24サンプルについて、DNAとRNAの両方実験） プロトコル Library PLUS Panel 1 kitに必要 プール/サン Panel 1 kitあた AmpliSeq Panel 試薬反応数/サ なLibrary PLUS プル りのサンプル数 ンプル 試薬反応数 2 DNA 1 DNA 24 DNA Comprehensive v3 48 2 RNA 1 RNA +24 RNA 24サンプル実 希望販売 サンプルあたり カタログ番号 製品名 施に必要な 価格（円） の価格（円） キット数 AmpliSeq Compre

  34. Slide 34: 実験準備

    実験準備 34 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  35. Slide 35: AmpliSeq for Illumina ケミストリー

    AmpliSeq for Illumina ケミストリー RNA逆転写 ハンズオン: 15分 AmpliSeq 合計 < 1時間 Panel Index plate RNA 増幅 アダプターライゲーション 増幅 定量とQC ライブラリープール ハンズオン: 15分 ハンズオン: 15分 ハンズオン: 10分 ハンズオン: 15分 ハンズオン: 10分 合計 1.5 – 4時間 合計 55分 合計 45分 合計 25分 合計 10分 クリーンアップ クリーンアップ 希釈とノーマライゼーション DNA 一部のアンプリコンを ハンズオン: 15分 ハンズオン: 15分 ハンズオン: 20分 消化 合

  36. Slide 36: 実験で使用する機器・器具一覧

    実験で使用する機器・器具一覧 核酸定量装置、PCR装置、マグネットスタンド、マイクロチップ電気泳動システムが必要です 製品 製品例 参考価格 台数 参考価格合計 備考 Pre-PCRとPost-PCRで 核酸定量装置（蛍光光度計） Qubit 4 ¥298,000 2 ¥ 596,000 各1台 ¥980,000 RNAを実施の場合は、 PCR装置 Veriti 200 ¥980,000 1-2 Pre-PCRとPost-PCRで -1,960,000 各1台 KUBOTA社 Pre-PCRとPost-PCRで プレート遠心機 ¥210,000 2 ¥420,000 各1台 PlateSpin

  37. Slide 37: 準備品： PCR装置

    準備品： PCR装置 ● 96ウェルプレート対応 サーマルサイクラー ヒートリッド機能付き （105℃設定） ● 以下の7機種において検証済 製品名 製造販売元 SimpliAmp Thermal Cycler サーモフィッシャー Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler サーモフィッシャー Veriti 96-Well Thermal Cycler サーモフィッシャー ProFlex 96-well PCR System サーモフィッシャー GeneAmp PCR System 9700 もしくは サーモフィッシャー Dual 96-well Therma

  38. Slide 38: 準備品：マグネットスタンド

    準備品：マグネットスタンド ● 実験で使用するチューブ、プレートによって異なるので注意 ● いずれか1つ準備 対応するチューブ、 製品名 製造販売元 カタログ番号 プレート 0.2mlの8連PCR DynaMag-96 Side Magnet サーモフィッシャー 12331D チューブもしくは 96ウェルプレート DynaMag-96 Side Skirted 96ウェルスカート サーモフィッシャー 12027 Magnet 付PCRプレート NGS MagnaStand 0.2mlの8連PCR 日本ジェネティクス FG-SSMAG2 （YS-Model) チューブ 38

  39. Slide 39: ラボレイアウト例

     シーケンサー設置条件： 室温22 ℃ ± 3℃、安定した実験台 ラボレイアウト例  別途サンプル受け入れ、サンプル抽出エリアを想定  サンプル抽出エリアでは、核酸定量装置を用いてQC  作業前後は、DNA/DNase (RNA/RNase) 除去剤により清拭  器具・消耗品は、Pre/Postのエリアでそれぞれ専用 90 cm 90 cm ミキ PCR ミキ サー サー 75 cm 装置 卓上 卓上 遠心機 遠心機 DNAスペース プレート RNAスペース 遠心機 Pre-PCRエリア ヒトの流れ Post-PCRエリア PCR 装置 ミキ マイクロ MiSeq サー チップ プレ

  40. Slide 40: 準備品：消耗品一覧

    準備品：消耗品一覧 製品名 製造販売元 カタログ番号 備考 Eppendorf DNA LoBind 0030108051 ローバインド1.5 mlチューブで エッペンドルフ Microcentrifuge Tubes, 1.5 ml あれば何でも可 Eppendorf twin.tec 96 Well LoBind 0030129504 ローバインドPCRプレートで エッペンドルフ PCR Plates, Semiskirted あれば何でも可 0.2 ml PCRチューブ、8連PCR 使用するサーマルサイクラー チューブ、もしくは96-well PCRプ に適合するものであれば何で レート

  41. Slide 41: 準備品：試薬一覧

    準備品：試薬一覧 製品名 製造販売元 カタログ番号 備考 エタノール 分子生物学グレードの試薬であ 和光純薬工業 321-00025 れば何でも可 Agencourt AMPure XP DNAおよびRNAサンプルあたり ベックマン・ 5ml: A63880 115ul（パネルによって異なる） コールター 60ml: A63881 を使用 イルミナSPBで代用可能 Nuclease-free ultrapure water 指定なし NaOH, molecular biology-grade 0.2Nで使用。1N NaOHなど濃度 指定なし の高いものを準備し、用事調製 Agilent DNA

  42. Slide 42: インプットDNA

    インプットDNA ● インプットDNA量： 1-100ng、プールあたり10ngを推奨 ● インプットDNA量は、基本的に多い方がライブラリーの品質は高い が、最大量の100ngを超えない範囲で（品質が不明の場合は高めの 濃度で） ● FFPE由来DNAのような分解されたサンプルでは収量が下がる傾向 にある ● 定量は、Qubit dsDNA HS Assay Kit や PicoGreenのような蛍光色 素を用いた定量法で行う 42

  43. Slide 43: インプットRNA

    インプットRNA ● インプットRNA量： 1-100ngのDNase処理したtotal RNAで逆転写 反応、プールあたり10ngを推奨 ● インプットRNA量は、基本的に多い方がライブラリーの品質は高い が、最大量の100ngを超えない範囲で（品質が不明の場合は高めの 濃度で） ● FFPE由来RNAのような分解されたサンプルでは収量が下がる傾向 にある ● 定量は、Qubit RNA HS Assay Kit や Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kitのような蛍光色素を用いた定量法で行う 43

  44. Slide 44: FFPEサンプル由来DNAの品質とカバレッジ均一性、オンターゲット率の関係

    FFPEサンプル由来DNAの品質とカバレッジ均一性、 オンターゲット率の関係 製品仕様 Cancer Hotspot v2 Focus Comprehensive v3 Comprehensive Cancer カバレッジ均一性2 オンターゲット率1 (%) (%) ΔCq 0.1 1.5 4.5 -1.8 0.3 1.2 1.5 3.0 6.4 6.9 7.2 0.1 1.5 4.5 -1.8 0.3 1.2 1.5 3.0 6.4 6.9 7.2 0.1 1.5 4.5 -1.8 0.3 1.2 1.5 3.0 6.4 6.9 7.2 0.1 1.5 4.5 -1.8 0.3 1.2 1.

  45. Slide 45: FFPEサンプル由来DNAの感度と検出限界

    FFPEサンプル由来DNAの感度と検出限界 10 ngインプットDNA、 MiSeqで95%のアンプリコンが500x以上を実現 HD798 HD799 HD803 Mild formalin Moderate formalin Severe formalin Observed Variant Frequency (%) ΔCq = 0.1 ΔCq = 1.5 ΔCq = 4.5 Illumina data on file Expected Variant Frequency (%) がんパネルと低品質 FFPEサンプルでの感度1と 5% MAF の検出限界 1. 研究における感度であり、診断に

  46. Slide 46: 実験ワークフロー

    実験ワークフロー 46 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  47. Slide 47: AmpliSeqライブラリー調製ワークフロー

    AmpliSeqライブラリー調製ワークフロー 1. 注意事項とライブラリー調製概要 2. DNA/RNAの準備 3. ライブラリー調製（Comprehensive Panel v3を例として） 4.ライブラリー評価 5. シーケンス条件 Appendix 47 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  48. Slide 48: 1. 注意事項とライブラリー調製概要

    1. 注意事項とライブラリー調製概要 ・事前注意事項 ● 試薬の凍結融解は6回まで。 6回以上に分けて実験を行う場合は、試薬の小分け分注をお勧めする。 ● Low TEは冷凍で届き、溶解に45分かかる。 一度溶解した後は室温で保管できる。 LowTEのボトル ● サーマルサイクラーでの反応では、Lid温度を105℃に設定する。 ● 実験を一時中断する時は、 ☆Safe Stopping Point の箇所で作業を止める。 ● 実験上の注意点は、 ☝重要Point ☝Point マークで表記している。 48 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  49. Slide 49: 注意事項 – ライブラリー調製

    ・注意事項 – ライブラリー調製 核酸 パネルの種類 DNAパネル Cancer Hot Spot v2, Comprehensive Cancer, 5種類 Exome, BRCA, Custom RNAパネル Immune Response, Human Transcriptome 2種類 Gene Expression, (Custom) DNA・RNAパネル Comprehensive Panel v3, Focus, 3種類 Community ☝Point DNAとRNAは別々にライブラリー作製。マージしない。 ● パネルによって反応条件が異なる箇所がある。事前にイルミナホームペー

  50. Slide 50: ライブラリー調製 概要

    ・ライブラリー調製 概要 DNA RNA Step0 逆転写cDNA合成 Step1 ターゲット領域の増幅（PCR） Step2 プライマー部分を分解（FuPa処理） Step3 i) インデックス-アダプターをライゲーション ii) ライブラリーの精製（AMPureビーズ精製） Step4 i) ライブラリーの増幅（PCR） ii) ライブラリーの精製（AMPureビーズ精製×2） 50

  51. Slide 51: 2. DNA, RNAの準備 ～DNA

    DNA 2. DNA, RNAの準備 ～DNA ● DNA濃度と溶解バッファー - 20～50 ng/μlの濃度で保管 - 標準使用量は10 ng/pool (high quality DNA) 2 poolの例： 4 ng/μlのDNA希釈溶液を、5ul使用（計20 ng） - DNA溶解バッファーはLowTEを推奨 高濃度のEDTAなど、PCR反応を阻害する試薬が入っていないバッファーを選ぶ。 ● 評価方法 - Qubitや PicoGreenなど、蛍光色素を用いた方法で定量 ☝Point NanoDropなど、UVスペクトルを用いた定量方法は不可 - DNA分解度合いの指標は無い 51

  52. Slide 52: 2. DNA, RNAの準備 ～RNA

    RNA 2. DNA, RNAの準備 ～RNA ● RNA濃度と溶解バッファー - 20～50 ng/μlの濃度で保管 ☝Point 事前にDNase処理しておく - 標準使用量は10 ng/pool (high quality RNA) 2 poolの例： 4 ng/μlのRNA希釈溶液を、5 μl使用（計20 ng） - RNA溶解バッファーはLowTEを推奨 高濃度のEDTAなど、PCR反応を阻害する試薬が入っていないバッファーを選ぶ。 ● 評価方法 - Qubit RNA HS Assay kitや RiboGreenなど、蛍光色素を用いた方法で定量 ☝Point NanoDropなど

  53. Slide 53: Step0 逆転写cDNA合成（RNAの場合のみ）

    RNA 3.ライブラリー調製 ～Comprehensive Panel v3を例として Step0 逆転写cDNA合成（RNAの場合のみ） ① FFPEから抽出したRNA・熱変性未実施のRNAは、80℃, 10分の加熱処理 その後室温に戻す ☝Point ② 5X AmpliSeq cDNA Reaction Mix*※ 2 μl ※AmpliSeq cDNA Synthesis for 10X AmpliSeq RT Enzyme Mix※ 1 μl Illumina Kit の構成品 Total RNA (2-100 ng) ≦7 μl （注意）お客様準備品 Nuclease-free w

  54. Slide 54: Step1 ターゲット領域の増幅 ～PCR：RNA

    Step1 ターゲット領域の増幅 ～PCR： RNA RNA 5X AmpliSeq HiFi Mix 赤キャップ ① 5X AmpliSeq HiFi Mix 4.5 μl ☝Point Step0で作製したcDNA 10 μl 多サンプルを同時調製する場合は、 Nuclease-free water 3.5 μl 1.5 mlチューブにcDNA以外の試薬 Total 18 μl を混合したMaster Mixを作成する ☝重要Point ② ピペッティングで混合、軽く遠心 パネルによってプール数が異なる 当該パネルのReference Guideの記載に従う ③ ②で作成した溶液を2分割す

  55. Slide 55: Step1 ターゲット領域の増幅 ～PCR：DNA

    Step1 ターゲット領域の増幅 ～PCR： DNA DNA ① 5X AmpliSeq HiFi Mix 5 μl 5X AmpliSeq HiFi Mix 赤キャップ DNA (2-100 ng) ≦7.5 μl Nuclease-free water 適量 ☝Point 多サンプルを同時調製する場合は、 Total 12.5 μl 1.5 mlチューブにDNA以外の試薬 を混合したMaster Mixを作成する ② ピペッティングで混合、軽く遠心 ③ ②で作成した溶液を2分割する - 5 μlをPCR tube (plate)のwell-1に入れる - 5 ulをPCR tube (pl

  56. Slide 56: Step1 ターゲット領域の増幅 ～PCR：RNA DNA

    Step1 ターゲット領域の増幅 ～PCR： RNA DNA ⑤ サーマルサイクラーでPCR反応 RNA プログラム名：AMP_RNA DNA プログラム名：AMP_DNA 99℃, 2分 99℃, 2分 99℃, 15秒 99℃, 15秒 60℃, 4分 ×27 60℃, 8分 ×14 10℃, Hold 10℃, Hold ☆Safe Stopping Point サーマルサイクラー内で24時間まで保管可能 長期保存する場合は、冷凍（-25℃～-15℃） ☝重要Point AMPプログラムの条件に注意  サイクル数などの条件は各パネルによって異なる。Reference Guideを確認

  57. Slide 57: Step2 PCRプライマー配列を部分分解 ～FuPa処理

    DNA RNA Step2 PCRプライマー配列を部分分解 ここから同じプロトコル ～FuPa処理 ① Step1で増幅した各pool (10 μl)を混合。 2 pool反応の場合は、 pool1 (10 μl) + pool2 (10μl) =Total 20 μl混合溶液 ② pool混合溶液 20 μl FuPa Reagent 茶キャップ FuPa Reagent 2 μl ☝重要Point Total 22 μl 混合溶液の体積とFuPa Reagentの量は 各パネルのプロトコルに従う ③ 軽くボルテックス＆遠心 ④ サーマルサイクラーで反応 Volume：22 μl 反応時間の

  58. Slide 58: Step3-i index-アダプターをライゲーション

    DNA RNA Step3-i index-アダプターをライゲーション ～PCRでシーケンスに必要な配列を結合 ① Step2で作成したFuPa処理DNAに、直接、下記の試薬を順番通り加える Step2の産物 22 μl AmpliSeq CD Indexes 96wellプレートに、インデックスの組み 1. Switchi Solution 4 μl 合わせがあらかじめ充填されている 2. AmpliSeq CD Indexes 2 μl 3. DNA Ligase 2 μl Total 30 μl Switch Slution 黄キャップ DNA Ligase 青キャップ ② 軽くボルテッ

  59. Slide 59: Step3-ii ライブラリーの精製 ～AMPure ビーズ精製

    DNA RNA Step3-ii ライブラリーの精製 ～AMPure ビーズ精製 ＜準備＞ - AMPureXPビーズを室温に戻す（30分以上） ☝重要Point 70%EtOHは用事調製 - 70% EtOHを作成（1サンプルあたり300μl） ① AMPureXPビーズをよくボルテックス ☝重要Point ビーズ量はパネルによって異なる ② DNAをビーズを結合させ、精製＆洗浄 1. ビーズ懸濁液30 μlを加える 2.ボルテックスし、ビーズとDNAを 完全に懸濁する →室温で5分間インキュベート 3. PCR tube (plate)をマグネットプレート 上に置き、～2分程度静置 →透明

  60. Slide 60: Step3-ii ライブラリーの精製

    DNA RNA Step3-ii ライブラリーの精製 4. マグネットプレート上で、ライブラリーが結合しているビーズを洗浄 a 70% EtOH 150 μlを加える b 室温30秒インキュベート ×2 ☝Point c 上清の70% EtOHを除去 ビーズの塊を崩さない ③ 70%EtOHを完全に除去 図．AMPure XP Beadsプロト コール https://ls.beckmancoulter.co.jp/pr 1. PCR tube (plate)を軽く遠心し、再度マグネット上に置く oducts/genomics/ampure-xp ※ビーズ塊とマグネットの位置関係が同じになるよ

  61. Slide 61: Step4-i ライブラリーの増幅 ～PCR

    DNA RNA Step4-i ライブラリーの増幅 ～PCR ① 1.5mlチューブにサンプル数分の試薬混合液を作製 1X Lib Amp Mix 45 μl 10X Library Amp Primers 5 μl 1X Lib Amp Mix 黒キャップ Total（1サンプルあたり） 50 μl 10X Library Amp Primers ピンクキャップ ② 軽くボルテックス＆遠心 ③ Step3-iiで乾燥させたビーズに、①で作製した50 μlの試薬Mixを直接加える ④ 軽くボルテックス＆遠心し、サーマルサイクラーで反応 プログラム名：AMP_7 Volume：50 μl 98℃

  62. Slide 62: Step4-ii ライブラリーの精製 ～2段階精製

    DNA RNA Step4-ii ライブラリーの精製 ～AMPure ビーズでの2段階精製 ＜準備＞ - AmpureXPビーズを室温に戻す（30分以上） - 70% EtOHを作成。1サンプル当たり300μlを使用（用事調製） ＜精製の原理＞ AMPureXPビーズ溶液と核酸溶液の体積比よって、ビーズに結合する核酸 のサイズが変わる 核酸溶液に対する、ビーズ溶液の体積比 夾雑物のDNA (Blue) DNAライブラリー (Red) ビーズに Step 1: 結合する 高分子量DNAを 核酸のサイズ Step 2 : ビーズに結合させ、 低分子量DNA 除去 を除去 図．Size Select

  63. Slide 63: Step4-ii ライブラリーの精製 - 2段階精製 -

    DNA RNA Step4-ii ライブラリーの精製 - AMPure ビーズでの2段階精製 - ① 室温に戻ったAmpureXPビーズを、よくボルテックス ② 大きなサイズのDNAをビーズに結合させ、除去 1. Step4-iで作製した各DNA溶液のwellに、AMPureXP懸濁液25μlを加える ☝Point WellにはDNA溶液50μlとビーズが入っている ここに直接ビーズ懸濁液を加える 2. ボルテックスし、ビーズとDNAを懸濁する ☝Point もとから入っていたビーズは固まっている もともと入っていたビーズ塊は完全に懸濁 しなくてよい 3. 室温で5分間インキュベート 4. P

  64. Slide 64: Step4-ii ライブラリーの精製 - 2段階精製 -

    DNA RNA Step4-ii ライブラリーの精製 - AMPure ビーズでの2段階精製 - ③ 透明になった上清（～75 μl）を、新しいwellに移す ☝重要Point 上清にライブラリーが含まれている。捨てないこと。 ④ もう一度ビーズ精製、短いDNAを除去 1. ③で新しいwellに移した上清に、 AMPureXP懸濁液60 μlを加える 2.ボルテックスし、ビーズとDNAを 完全に懸濁する →室温で5分間インキュベート 3. PCR tube (plate)をマグネットプレート 上に置き、～5分程度静置 図．AMPure XP Beadsプロトコール →透明になった上清（約135

  65. Slide 65: Step4-ii ライブラリーの精製

    DNA RNA Step4-ii ライブラリーの精製 4. マグネットプレート上で、ライブラリーが結合しているビーズを洗浄 a 70% EtOH 150 μlを加える b 室温30秒インキュベート ×2 ☝Point c 上清の70% EtOHを除去 ビーズの塊を崩さない →P20ピペットで残ったEtOHを全て吸い取る →室温で風乾5分 5. 30 μlのLowTEを加える →軽くボルテックス＆遠心 →PCR tube (plate)をマグネットプレート 上に置く 上清が透明になるまで～5分待つ 6. 上清27 μl（ライブラリーが溶出されている） 図．AMPure XP Beadsプロトコー

  66. Slide 66: 4. ライブラリー評価① ～ライブラリーの定量

    4. ライブラリー評価① ～ライブラリーの定量 ● ・ライブラリー調製が初めての方、不慣れな方はQubit, およBioanalyzer （もしくは同等品）の2手法で実施を推奨。 →手法間で、濃度に大きな差が無いことを確認する。 ● ・期待される収量は、Comprehensive Panel v3において - DNA：8～69 nM（10ngのHigh Quality DNAをinputとした場合） - RNA：12～190 nM（10ngのHigh Quality RNAをinputとした場合） ☝重要Point • ライブラリーの期待される収量は、各パネルによって異なる Reference

  67. Slide 67: 4. ライブラリー評価② ～ライブラリーの定性

    4. ライブラリー評価② ～ライブラリーの定性  ライブラリー1μlを使用 （BioAnlalyzer2100の場合。ライブラリー使用量は、使用機器・キットのガイドに従う。）  Agilent2100 Bioanalyzer DNA100キット、もしくはTapeStationなどの同等 品でDNAサイズを測定 図. Comprehensive Panel v3の例（DNAサンプル） ☝重要Point • BioAnalyzerの波形は各パネルによって異なる • 波形の典型例はReference GuideのCheck Libraries 項目、 Assess Library Quality

  68. Slide 68: 5. シーケンス条件① ～リード長

    5. シーケンス条件① ～リード長 ● 固定パネルは一律2×151 bpを推奨 ● カスタムパネルはインサートのサイズ*によって選択 インサートサイズ 推奨リード長（bp） 推奨シーケンサー （bp） ～140 bp 2×151 bp iSeq 100 MiniSeq ～175 bp 2×151 bp MiSeq NextSeq 500/550 ～275 bp 2×151 bp ～375 bp 2×301 bp MiSeq *インサートのサイズ ＝ ライブラリー全体のサイズ(bp) – 136 （アダプター配列の長さ） 68 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  69. Slide 69: 5. シーケンス条件② ～シーケンサーへのインプット量

    5. シーケンス条件② ～シーケンサーへのインプット量 ● 使用シーケンサーの適正濃度に従う。詳細は、下記Guideを参照する。 69 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  70. Slide 70: 実験ワークフローのまとめ

    実験ワークフローのまとめ 核酸の準備 ・Qubit、PicoGreenなど、蛍光色素を用いた定量 ターゲット領域の増幅 ・使用するパネル、および核酸の性状によって PCR条件が変わる PCRプライマー配列を部分分解 ・プール数によってFuPa Reagent量に注意 ・FuPa処理後は速やかに次の工程へ Index-アダプターをライゲーション – 精製 ・試薬を加える順番に注意 ・AMPure精製の最後は、ビーズを完全に乾燥 PCRでライブラリー増幅 – 精製 ・PCR後、２段階のAMPureビーズ精製 ・１段階目の精製では、上清を捨てずに回収する 必ず使用パネルのReference Guid

  71. Slide 71: Appendix 1 ～ライブラリー調製トラブルシュート

    Appendix 1 ～ライブラリー調製トラブルシュート ● トラブル①収量が少ない/無い ☆原因＿スタートDNA, RNAの品質が悪い ・ 特にFFPE由来の核酸など、品質の悪さが予想されるスタートサンプルは、 BioAnalyzerなどで分解具合を測定しておくと良い ☝Point 指標となる項目 ・DNA, RNA：DV200（長さ200bp以上のフラグメントの割合） ・RNA：RIN値 ☆原因＿その他 ・サーマルサイクラー、ヒートリッドの設定 ・AMPureビーズの取り扱い（ハンドリング、古い70%EtOH） ・適切ではない機器、消耗品 71 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での

  72. Slide 72: Appendix 1 ～ライブラリー調製トラブルシュート

    Appendix 1 ～ライブラリー調製トラブルシュート ● トラブル②バイオアナライザーでライブラリー以外にピーク ☆パターン 1＿～135bp付近のピーク → プライマーダイマー ＜原因＞ ・ AMPureビーズ精製が正しく行われていない ・ index-アダプターライゲーションのステップ で、正しい順番に試薬を加えていない ☝Point プライマーダイマーはフローセル上でクラスターを作成するため、ランや データ解析時にトラブルの原因になることがある。 ライブラリーに対して大量に存在している場合は、下記の方法で除去する。 ＜ピークの割合が大きい場合＞ ・ ライブラリー体積に対してx0.8量

  73. Slide 73: Appendix 1 ～ライブラリー調製トラブルシュート

    Appendix 1 ～ライブラリー調製トラブルシュート ● トラブル②バイオアナライザーでライブラリー以外にピーク ☆パターン 2＿高分子量側のピーク → AMPureビーズの持ち越し ＜解決方法＞ ・ AMPureビーズ精製に使用するマグネットを 磁性の強力な物に変える ・ ライブラリー溶出時のピペット操作を慎重に、ビーズをまき散らさない ・ 上清を分取するときは、ビーズを吸い込まないように 73 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  74. Slide 74: Appendix 1 ～ライブラリー調製トラブルシュート

    Appendix 1 ～ライブラリー調製トラブルシュート ● トラブル②バイオアナライザーでライブラリー以外にピーク ☆パターン 3＿ライブラリーのピークが分裂 → BioAnalyzerへのインプット量が多すぎる（濃度が濃すぎる） ＜対応方法＞ ・インプットするライブラリーを希釈する ・適切な濃度は使用キットによって異なる（添付ガイドを確認） ライブラリーのピークが、マーカーのピークより高い マーカーのピークより低くなるように濃度 ＝インプット量が多すぎる 調整すると、正しく測定できる 74 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  75. Slide 75: Appendix 2 ～インデックスアダプターの組み合わせ

    Appendix 2 ～インデックスアダプターの組み合わせ ● 8サンプル以上を同時にランする場合、組み合わせを考慮する必要はない ● 7サンプル以下で同時にランする場合は、下記URLの p19～“AmpliSeq for Illumina Pooling Guidelines ”を参照 http://jp.support.illumina.com/content/da m/illumina- support/documents/documentation/chem istry_documentation/experiment- design/index-adapters-pooling-gu

  76. Slide 76: Appendix 3 ～ Custom DNA panel 2 or 3 pool増幅

    Appendix 3 ～ （Custom DNA panel）2 or 3 pool増幅でのライブラリー調製 ● DNAの準備 - High quality DNAの場合、標準使用量は10 ng/pool - 標準使用量で調製する場合、インプットDNA濃度と体積は下記の表を参照 76 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  77. Slide 77: Appendix 3 ～ Custom DNA panel 2 pool Step1

    Appendix 3 ～ （Custom DNA panel）2 or 3 pool増幅でのライブラリー調製  Step1：2 poolでのターゲット領域増幅_反応試薬の調製 ☝Point 多サンプルを同時調製する場合は、 ① 5X AmpliSeq HiFi Mix 5 μl 1.5 mlチューブにMaster Mixを作成 DNA (2-200 ng) ≦7.5 μl Nuclease-free water 適量 Total 12.5 μl ④ ③で作成したwell-1 5 μl ② ピペッティングで混合、軽く遠心 2X AmpliSeq Custom DNA Pool 1 5 μl T

  78. Slide 78: Appendix 3 ～ Custom DNA panel 3 pool Step1

    Appendix 3 ～ （Custom DNA panel）2 or 3 pool増幅でのライブラリー調製  Step1：3 poolでのターゲット領域増幅_反応試薬の調製 ☝Point 多サンプルを同時調製する場合は、 ① 5X AmpliSeq HiFi Mix 7 μl 1.5 mlチューブにMaster Mixを作成 DNA (3-300 ng) ≦10.5 μl Nuclease-free water 適量 Total 17.5 μl ④ ③で作成したwell-1 5 μl 2X AmpliSeq Custom DNA Pool 1 5 μl ② ピペッティングで混合、軽く遠心

  79. Slide 79: Appendix 3 ～ ターゲット領域の増幅 PCR反応

    Appendix 3 ～ （Custom DNA panel）2 or 3 pool増幅でのライブラリー調製  Step1：ターゲット領域の増幅_サーマルサイクラーでPCR反応 ☝Point AMPプログラムの条件 プログラム名：AMP_DNA 99℃, 2分 サイクル数と60℃反応時間は、アンプリコン数 99℃, 15秒 によって異なる。下記Table 3を参照。 X cycles 60℃, X分 10℃, Hold 79 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  80. Slide 80: Appendix 3 ～ PCR条件について

    Appendix 3 ～ （Custom DNA panel）2 or 3 pool増幅でのライブラリー調製 ☆注意：PCR条件について ☝重要Point AMPプログラム補足 X cycles_サイクル数  各プールのアンプリコン数が違う（異なるサイクル数のカテゴリに入る）場合は、 サイクル数が多いほうに合わせる  規程のサイクル数 +3：- スタートDNA量が1ng/poolのとき - FFPEサンプルなど、スタートDNAの品質が悪いとき  規程のサイクル数 -3：High quality DNAで、スタート量が100 ng/poolのとき X 分_60℃反応時間  規程の時間 +

  81. Slide 81: Appendix 3 ～ Step2 FuPa処理

    Appendix 3 ～ （Custom DNA panel）2 or 3 pool増幅でのライブラリー調製  Step2：PCRプライマー配列を部分分解 （FuPa処理） ・ 2 pool ・ 3 pool ① 各10 μlのpool1とpool2を混合 ① 各10 μlのpool1～3を混合 ② pool1,2混合溶液 20 μl ② pool1～3混合溶液 30 μl FuPa Reagent 2 μl FuPa Reagent 3 μl Total 22 μl Total 33 μl ③ 軽くボルテックス＆遠心 ④ サーマルサイクラーで反応 プログラム名：FUPA 50℃, 10分

  82. Slide 82: Appendix 3 ～ Step3-i ライゲーション

    Appendix 3 ～ Custom DNA panel）2 or 3 pool増幅でのライブラリー調製  Step3-i：Index-アダプターをライゲーション ① FuPa処理したDNAに下記の試薬を順番通り加える 2 pool 3 pool (4 pool) ＋ FuPa処理DNA 22 μl 33 μl (44 μl) ② サーマルサイクラーで反応 プログラム名：LIGATE Volume 22℃, 30分 ・2 pool：30 μl 68℃, 5分 ・3 pool：45 μl 72℃, 5分 10℃, Hold 82 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  83. Slide 83: Appendix 3 ～ AMPure XPビーズで精製

    Appendix 3 ～（Custom DNA panel）2 or 3 pool増幅でのライブラリー調製  Step3-i：AMPure XPビーズで精製 ・アダプターライゲーションしたDNAにAMPureビーズ加える ・加える体積はプール数によって異なる。下記Tableを参照 以降の調製は、 全てのプール数で共通 83 製品の使用目的は研究に限定されます。診断での使用はできません。

  84. Slide 84: Appendix 4 ～紹介したプロトコル URL

    Appendix 4 ～紹介したプロトコル URL ● Comprehensive Panel ｖ３ Supportページ http://jp.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/ampliseq-for- illumina-comprehensive-panel-v3.html Reference Guide http://jp.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/ampliseq- for-illumina-comprehensive-panel-v3/documenta

Illumina — Technical Presentation (April 2018) on 6ix