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Illumina — bitBiome — Illumina Online Seminar: The New Future Enabled by the NextSeq 1000/2000 Series
45 slides from Illumina's conference presentation, May 12, 2020
Slide 1: bit-MAPによるシングルセルゲノム網羅解析
2020. May 12 イルミナオンラインセミナー NextSeq 1000/2000 シリーズが実現する新たな未来 ～最新ゲノム研究と今後の展望 ～ メタゲノムのその先へ bit-MAP®によるシングルセルゲノム網羅解析 Beyond metagenomes, bit-MAP® single-cell genomics illuminates microbiome functionality 細川 正人 bitBiome ㈱ CSO (Chief Scientific officer) 早稲田大学 招聘研究員 1
Slide 2: Speaker profile
— AE—A— {32% WLMCSO (Chief Scientific Officer) ANIL IEA RET (RET). Wt (LH). BRE PRR HR A OC2 (20084), MF HAR APD (20104) ISTSe PUTER (20154) 2HHS, MARIA MONA CY 2—-CORRIE DER 2013 LY SRBAFEMRMRCL YY tL RT ARE Lc, bitBiometest Ht 2018 MIR. ABRESFENFSRHIUSTSS A SEHHP EY
Slide 3: Who we are
– Who we are Illumina(イルミナ)社 早稲田大学発、18年11月創業の バイオテックベンチャー 世界初の “微生物のシングルセルゲノム 解析技術” bit-MAP®を用い、 パートナー企業/研究機関とともに、 ゲノム解析業界のリー ディング 至るところに存在する微生物を解析 カンパニーも 我々の技術に着目 Source: illumina社 web配布資料、QIAGEN社 メール 3
Slide 4: シングルセルゲノム解析とは…新たな微生物ゲノム解析戦略
シングルセルゲノム解析とは… 新たな微生物ゲノム解析戦略 単離培養株ゲノム ゲノム解析のアウトプット 単離培養株のDNA リファレンスゲノム拡張 微生物叢組成解析 • 古典的な単離培養/解析 多様な微生物の 集団 メタゲノム 全微生物DNAの混合物 • メタ16S rRNA解析 • ショットガンメタゲノム解析 遺伝子組成・パスウェイ解析 株レベルの多様性解析 シングルセルゲノム 1細胞から増幅したDNA • “bit-MAP®” 手法毎に得手不得手があるため、 適切な戦略を組み合わせることが重要 4
Slide 5: メタゲノム解析に続く、未培養微生物の直接解析法の新たな選択肢
メタゲノム解析に続く、未培養微生物の直接解析法の新たな選択肢： シングルセルゲノム解析 メタゲノム解析 全体を捉える メタ16S 解析 微生物叢組成解析 微生物コミュニティ 混ぜる DNAを抽出 ショットガンメタゲノム解析 全遺伝子組成解析 シングルセル解析 個別に評価する リファレンスゲノム拡張 微生物コミュニティ 細胞1個を分離 DNAを抽出し増幅 シングルセルゲノム解析 株レベルの多様性解析 5
Slide 6: 【課題】細菌叢組成解析では、正確な分類・機能理解に至らない
【課題】細菌叢組成解析(メタ16S rRNA解析)では、正確な分類・機能 理解に至らない NCBIに登録されている Streptomyces属ゲノム(n=259)を比較 16S rRNA identity と ANI (Average nucleotide identity) Chevrette et al. Front. Microbiol., 2019 16S rRNA遺伝子の相同性が高くても ゲノム全体の配列一致度は必ずしも高くない 補足 16SリボソームRNA（rRNA）identity： 多くの細菌叢研究で、97％以上の16S rRNA遺伝子配列同一性を共有するグループを分 離し、細
Slide 7: 株レベルで特定することが重要
コミュニティ全体としての微生物叢の理解に加えて、 カギとなる微生物を株レベルで特定することが重要 微生物のバランス/構成が健康のカギ 株レベルでの詳細な理解が重要 ▪ 11株の腸内細菌混合物が免疫 チェックポイント阻害剤との相 乗効果でCD8 T細胞を誘導する2 ▪ F.rodentium, H.biformis 株の作る抗腫瘍活性の短 鎖脂肪酸3 ▪ 腸内細菌叢の異常は複数の免疫関連疾患と相関1 ▪ 皮膚常在細菌-表皮ブドウ 球菌は個人ごとに株が異 なる4 Source: 1. Nat rev Immunol, 2. Nature, 3. Nat Microbol., 4. Cell 7
Slide 8: リファレンスゲノムが急速に蓄積されている
リファレンスゲノム(全遺伝子配列情報)が急速に蓄積されている 方策１：分離培養株からのゲノムシーケンス 方策２：メタゲノムからの微生物ゲノム再構築 Parks, D.H. et al. Nat Microbiol 2, Forster, S.C. et al. Nat 1533–1542 (2017). Biotechnol 37, 186–192 (2019). 公共データ1500件から 腸内細菌株 7,903ゲノム 737ゲノム Nayfach, S. et al. Nature 568, 505– 510 (2019). Zou, Y. et al. Nat Biotechnol 37,
Slide 9: メタゲノム由来の未培養細菌ゲノム情報が生物多様性の理解を押し広げている
メタゲノム由来の未培養細菌ゲノム情報が生物多様性の理解を押 し広げている メタゲノム解析で大量の新種微生物が推定 ⇒世界中の研究者がアクセス可能なリファレンスに Genome taxonomy database 14万バクテリアゲノム 24706種の40%がメタゲノム由来 A new view of the tree of life Hug, L. et al. Nat Microbiol 1, 16048 (2016). Parks, D., et al. Nat Biotechnol 36, 996–1004 (2018). ●は分離株の存在しない系統 9
Slide 10: ショットガンメタゲノムから微生物ゲノムを再構築する方法
ショットガンメタゲノムから微生物ゲノムを再構築する方法 アセンブリ⇒ビニング 1. 多種類のパズルを混ぜ合わせ、パズルの絵を想像しながらピースを組む =アセンブリ 2. まとまったピースの中からもっともらしい絵が復元される組み合わせを選ぶ =ビニング ※ ピースの集団には、欠けている箇所や間違ったピースが含まれている。使われないピースが大量に存在する ビニングツール(MetaBAT) Kang DD, et al PeerJ 2015 ゲノム品質評価ツール(CheckM) Parks DH, et al Genome Res. 2015 オリゴヌクレオチド頻度や量比からコンティグを分類 分類さ
Slide 11: ゲノムの完全性と汚染の品質評価
ゲノムの完全性と汚染の品質評価をシングルコピーマーカー遺伝子の 頻度に基づき推定する Bowers, R. et al. Nat Biotechnol 35, 725–731 (2017). Minimum information about a single amplified ゲノムの完全性、冗長性などから４水準に分けて、 genome (MISAG) and a metagenome-assembled ゲノム情報を登録することが推奨されている genome (MIMAG) of bacteria and archaea ※細川正人 実験医学増刊 Vol.37 No.20 シングルセルゲ
Slide 12: 【課題】メタゲノムビニングによるゲノム再構築の難点
【課題】メタゲノム ビニングによるゲノム再構築の難点 再現性： 品質： ビニングツールによって異なる結果を出力 ガイドライン基準を満たさない複合ゲノムがデータベースに登録 Shaiber A. et al. mBio Jun 2019, 10 (3) e00725-19; Sieber, C.M.K. et al. Nat Microbiol 3, 836–843 (2018). Espinoza, JL. et al. mBio Nov 2018, 9 (6) e01631-18; その他にも、 • 計算に時間がかる (日~週単位) • 多様性が高いサンプル、近縁の菌種が多いサンプルほどビニ
Slide 13: シングルセルゲノム解析
リファレンスゲノムの網羅的な獲得を可能とする次世代技術 シングルセルゲノム解析 複雑系のまま、全体像を理解しようとする 個々に分解してから、１つずつ理解を始める =メタゲノム =シングルセルゲノム 13
Slide 14: あらゆる生物学研究でシングルセル解析が当たり前に
過去10年で、あらゆる生物学研究でシングルセル解析が当たり前に 動物細胞に特化したシングルセルゲノム解析技術 多彩な製品・サービスが展開 Fluidigm Agilent TAKARA, Celsee 10X Genomics, Bio-Rad Dolomite Bio, 1CellBio, Mission Bio 10年でスループットは100,000倍向上 Svensson et.al Nature Protocols(2018) 14
Slide 15: シングルセルテクノロジー×DNAシーケンシング
シングルセルゲノム解析 = シングルセル(前処理)テクノロジー×DNAシーケンシングテクノロジー シングルセルテクノロジー シーケンシング 細胞サンプル Bioinformatics (微量DNAをシーケンスする前処理) テクノロジー ショートリード シングルセルに合わせた 動物細胞 過去１０ 年で様々な技術が開発・市販化 解析パイプラインが必要 Svensson et al. Nature Protocols(2018) ロングリード マイクロバイオーム 微生物に特化した技術/製品が無い 出典元 (© 2016 DBCLS TogoTV) シーケンスプラットフォームは ユーザーの知りたい情報
Slide 16: 微生物シングルセル解析だけが10年間ほぼ進化していなかった
微生物シングルセル解析だけが10年間ほぼ進化していなかった 一般的なシングルセルゲノム解析ワークフロー シーケンス シーケンス アセンブリ サンプル シングルセル分取 溶菌 全ゲノム増幅 クオリティチェック ライブラリ調製 CTTGCAAACT Wet: 3~5 days Dry: > 12h • 設備投資が必要 (クリーンルーム, FACS, 1細胞ゲノム増幅等試薬, NGS, データ解析環境) • 作業者の訓練が必要 • 歩留まり・再現性の悪い実験系 (たまたま上手く行った例や質の低いデータの報告がほとんど) シングルセルゲノム解析の成功に必要な4つの条件 清浄な反応環境 高いスループット
Slide 17: ドロップレット・マイクロフルイディクス
ドロップレット・マイクロフルイディクス 高速・大量に作る シングルセル捕捉 微生物 30 μm 30 μm 薬液を混ぜる 微生物を増やす Kogawa et al., Sci. Rep. 8, 2059 (2018) , Hosokawa et al., Sci. Rep. 7, 5199 (2017) Nishikawa et al., Plos One 10, e0138733 (2015) 17
Slide 18: SAG-gel法を開発
シングルセルゲノム解析の必要４条件を備えたブレイクスルー技術 SAG-gel (Single-cell amplified genome in gel)法を開発 網羅的にシングルセルを単離 1チューブで試薬を順次添加/洗浄 増幅ゲノムを選抜 Chijiiwa et al., Microbiome 2020, https://doi.org/10.1186/s40168-019-0779-2 Nishikawa et al., bioRxiv 2020, https://doi.org/10.1101/2020.03.05.962001 18
Slide 19: 1チューブで数千~数万のシングルセルゲノムを独立増幅
1チューブで数千~数万のシングルセルゲノムを独立増幅 細胞封入 カプセル間でのコンタミネーションはない FACSで容易に分取可能 ドロップ レット オイル層 カプセル化 水層 ゲル カプセル 増幅DNAを含むカプセル グラム陽性菌からもゲノム解読可 カプセル内 酵素溶菌 ゲノム増幅 一般的な 空のカプセル アルカリ溶菌 19
Slide 20: 応用例1:網羅的シングルセルゲノム解析から特定の細菌の機能を知る
応用例１：網羅的シングルセルゲノム解析から特定の細菌の 腸内細菌 機能を知る Chijiiwa et al., Microbiome 2020, https://doi.org/10.1186/s40168-019-0779-2 BALB/c SAG Library 調製 3日 シーケンシング 試料調製 0.5日 ドラフトゲノムの完全性・冗長性は CheckM にて評価 Parks DH. Et al., Genome Research, 25: 1043-1055. 20
Slide 21: 302個のSAGから31種の腸内細菌ドラフトゲノムを獲得
302個のSAGから重複のない31種のHQ, MQ腸内細菌 腸内細菌 ドラフトゲノムを獲得 Chijiiwa et al., Microbiome 2020, https://doi.org/10.1186/s40168-019-0779-2 Total length Completeness Contamination SAG SAG ID Lineagea # contigs N50 (bp) GC (%) # CDS (Mb) (%)b (%)b qualityc IMSAGC_001 Bacteroidota;Bacteroidia;Bacteroidales;Bacteroidace
Slide 22: イヌリン代謝を担うBacteroides属細菌の比較ゲノム解析
食物繊維イヌリンの代謝を担うBacteroides属細菌の 腸内細菌 比較ゲノム解析 Chijiiwa et al., Microbiome 2020, https://doi.org/10.1186/s40168-019-0779-2 メタゲノム解析 シングルセルゲノム解析 バクテロイデス科細菌(青)の増加 イヌリン給餌マウスSAGのデータリストから メタボローム解析 バクテロイデス細菌ゲノムを選別 ２週間のイヌリン給餌 盲腸内容物中のコハク酸の増加 ２つの新規株ゲノム 22
Slide 23: イヌリン利用遺伝子座・コハク酸代謝経路を特定
イヌリン利用遺伝子座・コハク酸代謝経路を特定し、 腸内細菌 代謝メカニズムを証明 Chijiiwa et al., Microbiome 2020, https://doi.org/10.1186/s40168-019-0779-2 コハク酸産生経路 コハク酸合成経路 メタ16S解析では説明できなかった、未培養細菌の機能をゲノムデータから説明 23
Slide 24: 応用例2:環境サンプルから大規模に細菌ドラフトゲノムを取得する
応用例２：環境サンプルから大規模に細菌ドラフト 土壌・海洋細菌 Nishikawa et al., bioRxiv 2020, ゲノムを取得する https://doi.org/10.1101/2020.03.05.962001 マングローブ土 海水 海水(外洋) 海泥 海岸砂 土漠 海泥(冷凍) 734SAG 人工砂浜 人工砂浜 土漠 マングローブ土壌 海泥 海泥(冷凍) 海岸砂 海水 海水(外洋) 多種多様な細菌ドラフトゲノムが一度に得られる 231種中228種が未記載種 24
Slide 25: 環境毎の特徴抽出、ウイルス様配列、生合成遺伝子を同定
環境毎の特徴抽出、細菌のもつウイルス様配列、生合成 土壌・海洋細菌 Nishikawa et al., bioRxiv 2020, 遺伝子を同定 https://doi.org/10.1101/2020.03.05.962001 (全体像)環境特異的遺伝子群 (個別像)各細菌の詳細情報 マングローブ土壌の例 細菌属 ゲノムの完全性 ウイルス由来配列(ファージなど) 生合成遺伝子(二次代謝産物など) シングルセル解析導入の効果 複雑系の中での各細菌の機能を知る 解析細胞数のスケールアップが可能 ターゲット細菌を選抜し解析 海水 海岸砂 人工砂浜 土漠 海泥 海水(外洋) 海泥(冷凍)
Slide 26: 応用例3:ヒト腸内細菌からのドラフトゲノム獲得
応用例３:ヒト腸内細菌からのドラフトゲノム獲得 腸内細菌 メタゲノムとの比較、新規ゲノムの割合は？ Unpublished data 被験者8名の平均： ドラフトゲノムの平均10%が未記載種 、24%が分離株なし (頻度は被検者に依存) A C D E シングルセル (外円) メタゲノム (内円) F G H M 26
Slide 27: ヒト腸内細菌同一種の中の亜種(株)を特定
腸内細菌 ヒト腸内細菌同一種の中の亜種（株）を特定 Unpublished data ANI Score 16S rRNA遺伝子により同一種として同定された (Average Nucleotide Identity) ヒト腸内細菌 種aの種内比較ヒートマップ 100 99 98 97 High Low 被験者A 菌A-1 由来 株i A-2 A-3 被験者A内でも二種類 株ii の異なる株が存在する A-4 被験者B 菌B-1 由来 B-2 B-3 株iii 被験者Aと被験者Bでは B-4 腸内細菌の株が異なる B-5 B-6 菌Ｂ - 菌Ａ - Ｂ - Ｂ - Ｂ - Ｂ - Ａ - Ａ -
Slide 28: bitBiomeの提供するbit-MAP解析サービス
bitBiomeの提供するbit-MAP® 解析サービス 28
Slide 29: bit-MAP bitBiome Microbiome analysis platform
bit-MAP® bitBiome Microbiome analysis platform SAG-gelを活用したシングルセルゲノム解析サービス：ウェットからドライまで一貫して実施 細菌叢 シングルセル化 ゲノム抽出 ゲノム増幅 シーケンス データ取得 Chijiiwa et al., Microbiome 2020 ※同一サンプルからのショットガンメタゲノムの並行解析も実施可能 お問い合わせ コンサルティング サンプルの調製と発送 シーケンス/データ解析 データレポート提供 ご用途・ご予算をもとに、 お客様に実施していただきます bitBiomeにて実施します 納品物 解析メニューをご提
Slide 30: 基本プロトコル: 1検体あたり96シングルセルを解析
参考) 基本プロトコル: １検体あたり96シングルセルを解析 微生物96個体のゲノムを解析 解析レポート １検体 微生物叢 (96ウェルプレートを使用) 単離・ DNA増幅等 ゲノム配列データ • 各ウェルには、単離・DNA増幅が確認 された「1微生物由来のDNAサンプル」 • 同種の微生物が異なるウェルに含まれるこ 等 とにより、96個体の解析結果の一部が重複 (プランに する場合も存在 (優先種など) 応じて) 30
Slide 31: bit-MAPのBioinformaticsプロセス
bit-MAP®のBioinformaticsプロセス 自社の独自解析パイプライン シングルセル De De novo novo ドラフトゲノム 系統解析 より詳しく知る NGS生データ assembly assembly (品質評価) 遺伝子領域推定 機能解析 次世代シーケンサー 配列情報をつなぎ合 独自データベースを参照 どの細菌が特徴的に 代謝経路予測 でDNA配列を読む わせゲノムを復元 しゲノムを精緻化 現れるか？ 微生物ゲノム データベース どんな遺伝子を保有し タンパク質構造予測 ているか？ シングルセルだけでなく ショットガンメタゲノム ロングリードメタゲノム などの解析技術も
Slide 32: bit-MAPの特長/優位性
bit-MAP®の特長/優位性 広範なカバレッジ 高解像度 高品質データ ハイスループット • 多種多様な微生 • 種レベルの下の • １微生物由来 • 低コストに 物に対応可能 株レベルまで ゆえ汚染がなく、 リファレンス 解析可能 完全性の高いゲ ゲノムを取得 ノムデータ 32
Slide 33: 微生物のシングルセルゲノム解析により何が得られるのか
微生物のシングルセルゲノム解析により何が得られるのか 1 未培養微生物を含む 微生物リファレンスゲノムデータベースを構築できる 2 ある生命現象が、どの微生物の どの機能と関連しているのか、精密に理解できる 3 メタゲノムでは解析では困難な、 超多様・近縁種混在・DNA回収困難なサンプルにも対応できる 33
Slide 34: メタ16S・メタゲノム・シングルセル解析の比較
微生物群の解析で シングルセル解析で 抽象的に全体像を捉え… ターゲットを完全に理解する メタ16S rRNA解析 bit-MAP®による • 微生物群に含まれる菌の メンバーリストを手早く解析可 シングルセル解析 • 機能解析はできず、系統解析に特化 • 1個体ごとに、株レベルで • 存在率が低い種は “その他” 扱い 16S ゲノム配列から機能を解析 • その元となるゲノム配列は、 間違いなくシングルセル由来 ショットガン • レア種/難培養種まで幅広く メタゲノム解析 解析可能 • 微生物群全体の組成/機能を解析可 • 一方、近縁種の比較やレア種のデー タ取得は難しい • 断片化された種
Slide 35: 微生物のゲノムカタログを創り、次世代の産業応用へ
メタ情報と組み合わせた微生物のゲノムカタログを創り、 次世代の産業応用へ 複雑な シングルセルゲノミクスにより パートナー企業/研究機関とともに 微生物コミュニティから、 個別の微生物の 産業応用へ ゲノムカタログを作り、 35
Slide 36: bitBiome's mission
bitBiome’s mission exp(Σ0→1) ～ 絶え間ない新たな科学的発見の土台となり、知を爆発的に集積し、 医療や産業資源への応用を通じて豊かな世界を実現します ～ Activate the world with bitBiome, and with microorganism 36
Slide 37: Q&A
Q&A FB ee: EB bitBiome 37
Slide 38: Appendix 技術関連
Appendix xiii FB ee: EB bitBiome 38
Slide 39: bit-MAPとショート・ロングリードのハイブリッドシーケンス
bit-MAP®とショート・ロングリードの ハイブリッドシーケンス シングルセルテクノロジー シーケンシング 細胞サンプル Bioinformatics (微量DNAをシーケンスする前処理) テクノロジー ショートリード 当社独自のショート・ロン グリードのハイブリッド解 シングルセル由来ゲノムDNA 析を確立済み ライブラリー ロングリード bit-MAP® 混在した細胞情報を 整理・保管できる形にし 複数の方法で読み取りつなぎ合わせる bitBiomeでは、上記フローによりロングリードの運用も行っており、 未培養腸内細菌のシングルセルゲノムでもほぼ１本のドラフトゲノムにできることを確認済み
Slide 40: ビニング直後のMAGの利用は注意が必要
ビニング直後のメタゲノム由来ドラフトゲノム(MAG)の利用は 注意が必要 Hosokawa et al., in prep. 15種の細菌株を含むNBRC微生物カクテル 実際のヒト糞便サンプル 緑系：Actinobacteria 赤系：Bacteroidia 青系：Bacilli, Clostridia 茶系：Negativicutes 橙系：Vampirovibrionia 黒 ：未対応 横軸：Non-redundant MAGs 縦軸：Composite SAGsと相同性の高いコンティグの割合 個々のMAGは一種(単一SAG)に対応している MAGの多くが複数種の細菌由来の複合ゲノム? 標
Slide 41: 細菌/遺伝子の伝搬の追跡にも利用の可能性
腸内細菌 細菌/遺伝子の伝搬の追跡にも利用の可能性 Hosokawa et al., in prep. F G C Type 1 Type 2 CDS identity Type 3 Type 4 同一種細菌の比較ゲノム解析 H A M ある細菌種では、家族間(３名 夫婦・親子)で同一 同一細菌種の比較ゲノム解析 株(>99.9%)を保有 特定遺伝子上で規則的に出現する変異を発見 他人とは明確に異なる家族特有の株? 41
Slide 42: Our single-cell genomics deliver deeper insights
Our single-cell genomics deliver deeper insights in addition to existing outputs 16S rRNA Shotgun Single-cell genomics Single-cell metagenomics metagenomics (bitBiome) genomics can PCR amplification only explain who Image is doing what 16SrRNA sequencing Purpose Microbiome composition Composition &
Slide 43: Why we focus on microbe Genome?
Why we focus on microbe "Genome"? ゲノム解析コストが劇的に低下し、 欧米では微生物ゲノムデータをもとに 生物の設計図(ゲノム)をおさえられる時代に 革新的な製品を生み出す企業が続々登場 遺伝情報解読のコスト→10年前の10000 分の１ 薬剤耐性菌に効く 遺伝情報(ゲノム) 微生物の機能を モノづくりを 新しい抗生物質 から 知り する時代 農作物の収穫を 増やす微生物農薬 腸内疾患を治す 微生物による 新規薬剤 しかし、あらゆる産業にかかわる微生物に関する、 高品質で包括的なデータを持つプレイヤーはいない 43
Slide 44: What we want to achieve
Inc. – What we want to achieve Microbe genomes in the database (cumulative) # of genome registered ~hundreds 300,000 bitBiome of thousands bit-MAP🄬🄬 250,000 With our platform, Large scale 200,000 single-cell explosively NGS, accumulate microbe 150,000 metagenomics genomes in a few Illumina…
Slide 45: bitBiome
7 ¥ bit Biome %
bitBiome — Illumina Online Seminar: The New Future Enabled by the NextSeq 1000/2000 Series on 6ix