Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (March 2019)
44 slides from Illumina's technical presentation, Mar 27, 2019
Slide 1: トラブルシューティング編 ～Bioanalyzerを使用したライブラリーQCと適切な定量方法～
トラブルシューティング編 ～Bioanalyzerを使用したライブラリーQCと適切な定量方法～ 【イルミナiSchool 初級】 小寺 啓文 テクニカルアプリケーションサイエンティスト March 27, 2019 © 2019 Illumina, Inc. All rights reserved. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 2: 本日の Outline
本日の Outline ● なぜライブラリーQCが必要か？ - 正確なライブラリーサイズ（構造）を知ることの重要性 - 正確にライブラリー濃度を測定する重要性 ● 最終ライブラリーの期待されるトレース - 期待されるトレース （TruSeq DNA Nano, TruSeq PCR Free, RNA-seq libraries, TruSeq Small RNA, Nextera XT, Nextera DNA Flex, Ampliconライブラリー） ● 起こりうる問題点および対策 - 期待と異なるサイズ （TruSeq DNA kits, TruSeq RNA kits, Nexter
Slide 3: なぜライブラリーQCが必要か？
なぜライブラリーQCが必要か？ 適切なライブラリー構造と濃度は、 データ品質と総データ出力量の点で シーケンスパフォーマンスに 大きな影響を与えます。 期待通りのラン結果を得るためには、 ライブラリーの品質管理が重要です。 3
Slide 4: 正確なライブラリーサイズ（構造）を知ることの重要性
正確なライブラリーサイズ（構造）を知ることの重要性 ● もし、ライブラリーにアダプター配列が適切に付加されていない場合には フローセル上でクラスター形成ができないため、データが得られません。 ● 各種フローセルに対して、適切な最終ライブラリー濃度があります。 もし、ライブラリーのサイズを適切に測定できていない場合には モル濃度が適切に計算できないため、 ライブラリー濃度を誤るリスクが生じます。 ● アダプターダイマーはフローセル上でクラスターを形成するため、 もし、高い割合のアダプターダイマーの混入がある場合 アダプターダイマー由来のリードに データ量を奪われてしまうデメリットがあります。 F
Slide 5: 正確にライブラリー濃度を測定する重要性
正確にライブラリー濃度を測定する重要性 推奨クラスター密度（PhiX Control ライブラリーの場合） PhiX loading concentrations for validation runs on Illumina sequencing platforms http://jp.support.illumina.com/content/illumina-support/apac/ja_JP/bulletins/2016/10/phix-loading- concentrations-for-validation-runs-on-illumina-sequencing-platform
Slide 6: 正確にライブラリー濃度を測定する重要性
正確にライブラリー濃度を測定する重要性 ● ライブラリー濃度が高すぎる（クラスター密度が高すぎる）場合、 %PF（取得データ量）の低下や、クオリティ低下がおこりえます。 Qualityの低下 クラスター密度 Pass Filter を通過した クラスターの密度 （実際に得られるデータ量） 6 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 7: 正確にライブラリー濃度を測定する重要性
正確にライブラリー濃度を測定する重要性 ● さらに極端にクラスター密度が高すぎる、または低すぎる状態は クラスター由来の蛍光とバックの明るさの比（Signal to Noise比）が 低くなりフォーカスを合わせにくくなるため、 フォーカスエラーでランが中断する原因になり得ます。 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 7
Slide 8: 本セッションの目的
本セッションの目的 期待通りのシーケンス結果が得られるように、 弊社のライブラリー調製キットを用いて得られたライブラリーに対して 適切なライブラリー構造が得られているのかが確認できるようになることを目的とし その目的の達成のために バイオアナライザーで品質チェックした場合の １）期待される検出パターンをご案内するとともに、 ２）予想とは異なる結果が得られた場合のトラブルシューティングの方法 についてご案内いたします。 関連ウェビナー録画 （ライブラリーが原因で生じる問題について） SAV（Sequencing Analysis Viewer）でランの評価と改善を行う https://jp.il
Slide 9: 本日のTopic
本日のTopic 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの消失 大きなサイズ 小さなサイズの 結果 サイズ のピーク ピーク • TruSeq Nano DNA, TruSeq DNA PCR Free DNA ライブラリー • Nextera DNA, Nextera DNA Flex, Nextera XT • TruSeq Stranded mRNA, TruSeq Stranded Total RNA, TruSeq RNA V2 RNA ライブラリー • TruSeq RNA Exome • TruSeq Small RNA • TruSeq Targeted RNA
Slide 10: 本日のTopic
本日のTopic 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの消失 大きなサイズ 小さなサイズの 結果 サイズ のピーク ピーク ウェビナー録画 （本日ご紹介しないDNA濃縮ライブラリーや AmpliSeqライブラリーに関するウェビナー） • DNA Enrichment ライブラリー TruSeq Rapid Exome & TruSeq Exome Library Prep Kitを用いた Easy Prep Exome【イルミナiSchool 中級】 • https://jp.illumina.com/events/webinar/archive/webinar_160527_
Slide 11: For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの消失 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ のピーク のピーク For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 11
Slide 12: 期待されるトレース
期待されるトレース 定性では、アガロースゲル電気泳動よりも、 より精密にライブラリーサイズを確認する必要がある → Bioanalyzerの使用が有効！ B fluorescence units 蛍光強度 平らなベースライン base pairs [bp] Lower marker Library B Upper marker 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ 消失 のピーク のピーク 12
Slide 13: 期待されるトレース: TruSeq DNA Nano
期待されるトレース: TruSeq DNA Nano TruSeq DNA Nano 350 bp insert TruSeq DNA Nano 550 bp insert TruSeq Nano DNA Kit は、SPB ビーズによるサイズセレクションがある。 最終ライブラリーには、インサートと～120 bp (single indexed adapter) または～135 bp (CD index kit or UD index kit) のアダプターが含まれる。 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ 消失 のピーク のピーク
Slide 14: 期待されるトレース: TruSeq PCR Free
期待されるトレース: TruSeq PCR Free TruSeq PCR Free 350 bp insert TruSeq PCR Free 550 bp insert 700 bp前後にピーク 1000 bp前後にピーク l l l 最終ライブラリーの l l トレース l l バイオアナライザーのマーカーが 2本鎖DNAなのに対して、末端の Y字アダプターは1本鎖であるため、 立体障害の影響により泳動速度が 遅くなり、 実際よりも大きなライブラリーサ イズのピークとして検出されます。 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ 消失
Slide 15: 期待されるトレース: RNA-Seq libraries
期待されるトレース: RNA-Seq libraries TruSeq RNA ≈ 260 bp ライブラリーサイズがブ ロードに見える理由は、 RNAの断片化に熱処理が TruSeq RNA V2 行われている点と、 TruSeq Stranded mRNA サイズセレクションの ステップがないため TruSeq Stranded Total RNA TruSeq RNA Exome (before capture) 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ 消失 のピーク のピーク 15
Slide 16: 期待されるトレース: TruSeq Small RNA
期待されるトレース: TruSeq Small RNA TruSeq Small RNAライブラリーは、 20-30ヌクレオチドのsmall RNAにアダプターが付加されたライブラリー（145～160 bp） ゲルからの切り出し（PAGE）精製を 最終ライブラリーのトレース する範囲: ~145-160bp ゲル精製 ~145-160 bp シングルピーク 多くのピークが見られるのは問題ない所見 これらの小さなピークは プライマーとプライマーダイマー 160 bpより大きいピークは、 より大きなRNA種由来 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの 大きなサイズ 小さなサイズ 結
Slide 17: 期待されるトレース: Nextera XT
期待されるトレース: Nextera XT Nextera XTライブラリーは、幅広いサイズ分布（250 bp ～ 1500 bp）を示す Nexterara XTライブラリーは物理的なせん断ではなく、酵素的断片化を行う。 また、断片化後のサイズ選択はないため、 ライブラリーのサイズは他のライブラリーよりもブロードになる。 Nextera XTライブラリーでは、最終ライブラリーのトレースが、 図のようにライブラリーによって異なるトレースを示しても、どちらもシーケンスが可能。 また、ライブラリーサイズが小さいものの方がクラスター形成効率が高いため、 実際に得られるデータの平均サイズは、トレース上
Slide 18: 期待されるトレース: Nextera DNA Flex
期待されるトレース: Nextera DNA Flex Bioanalyzer (High Sensitivity DNA kit) およそ150bpから1500bp付近のサイズ分布 を示し、平均サイズは~600bp ウェビナー録画 進化したNextera DNA Flexを用いたライブラリー調製【イルミナiSchool 初級】 https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-181031-j.html 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ 消失 のピーク のピーク 18
Slide 19: 期待されるトレース: Ampliconライブラリー
期待されるトレース: Ampliconライブラリー TruSeq Targeted RNA Expression TruSight Tumor 15 Amplicon ベースのライブラリーでは、 目的のライブラリーサイズの位置にシャープなピークが得られる。 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ 消失 のピーク のピーク 19
Slide 20: For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 20
Slide 21: 期待と異なるサイズ: ライブラリーのオーバーロード
期待と異なるサイズ ライブラリーのオーバーロード オーバーロード 適切な範囲 マーカーのピークを識別することができない ライブラリーのサイズを確認することが難しい アーチファクトのピークが生じる可能性あり 解決法： ライブラリーを希釈したのち、再解析を行う 適切な検出限界の Bioanalyzer chip を使用する － High Sensitivity DNA Assay: 5～500 pg/μL － DNA 1000 Assay: 0.1～50 ng/μL － RNA 6000 Nano total RNA Assay: 5～500 ng/μL － RNA 6000 Pico total
Slide 22: 期待と異なるサイズ: TruSeq DNA kits
期待と異なるサイズ: TruSeq DNA kits 小さすぎるライブラリーサイズ 大きすぎるライブラリーサイズ 考えられる原因 対策 考えられる原因 対策 インプットDNAの ゲル電気泳動、または インプットDNAの量 QubitまたはPicogreen 質が悪い Bioanalyzerのトレースで が多すぎる を用いて定量する DNAが断片化されていないこと を確認する 高分子量DNA除去の 上清を捨てずに、次の 過程で、目的の（小さ ステップに用いる インプットDNAの QubitまたはPicogreenを用いて な）DNAが含まれる 量が不十分 定量を行う 上清を捨ててしまった （DN
Slide 23: 期待と異なるサイズ: TruSeq RNA kits
期待と異なるサイズ: TruSeq RNA kits 小さすぎるライブラリーサイズ 大きすぎるライブラリーサイズ 考えられる原因 対策 考えられる原因 対策 サーマルサイクラー サーマルサイクラー サーマルサイクラー サーマルサイクラー の温度が指定温度よ の温度調整が正確か の温度が指定温度よ の温度調整が正確か りも高い を確認 りも低い を確認 (RNA-seq) (RNA-seq) Elute, Prime, Frag 質の良いRNAを用い Elute, Prime, Frag 質の良いRNAを用い インキュベーション てElute, Prime, Frag インキュベーション てEl
Slide 24: 期待と異なるサイズ: Nextera XT
期待と異なるサイズ: Nextera XT Nextera XTの場合の 理想的なトレース例 小さすぎるライブラリーサイズ 望ましい 断片化した Input DNA DNA 考えられる原因 対策 インプットDNAの質が悪い ゲル電気泳動、またはBioanalyzerのトレースで DNAが断片化されていないことを確認する インプットDNAの量が不十分 QubitまたはPicogreenを用いて定量を行う （DNA希釈前の定量がより正確） タグメンテーションの反応時間が長すぎる タグメンテーション後、すぐに次のポイントに進む または反応温度が推奨より高い サーマルサイクラーの温度調整が正確かを確認
Slide 25: 期待と異なるサイズ: Nextera libraries
期待と異なるサイズ: Nextera libraries Nextera XTの場合の 理想的なトレース例 大きすぎるライブラリーサイズ 考えられる原因 対策 インプットDNAの量が QubitまたはPicogreenを 多すぎる 用いて定量を行う タグメンテーションの タグメンテーションの時 反応時間が短すぎる、 間を守る。サーマルサイ または反応温度が低い クラーの温度調整が正確 かを確認 タグメンテーションの酵 インプットDNAに夾雑物 素が阻害されている が含まれていないか確認 タグメンテーションの酵素を阻害する物質としては、 抽出したインプットDNAに含まれるEDTAやアルコールなど
Slide 26: Nexteraライブラリーのトラブルシューティング
Nexteraライブラリーのトラブルシューティング ウェビナー録画 - Nextera XT トラブルシューティング編 - Nexteraライブラリー調製キットシリーズで 期待通りのライブラリーを得るためのヒント【イルミナiSchool】 https://jp.illumina.com/events/webinar/archive/webinar_150306_j.html - Nextera DNA Flex 進化したNextera DNA Flexを用いたライブラリー調製【イルミナ iSchool 初級】 https://jp.illumina.com/events/webinar/201
Slide 27: For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
目的外の 目的外の 期待される結 期待と異なる ピークの消失 大きなサイズ 小さなサイズ 果 サイズ のピーク のピーク For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 27
Slide 28: ピークの消失: TruSeq and Nextera libraries
ピークの消失: TruSeq and Nextera libraries ライブラリーのピークが見られない、もしくはダイマーのピークしか見えない。 ライブラリーの定量でも濃度が確認できない場合には、 ライブラリーを再度、調製していただく必要がある。 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ 消失 のピーク のピーク 28
Slide 29: ピークの消失: TruSeq DNA and RNA libraries
ピークの消失: TruSeq DNA and RNA libraries 考えられる原因 対策 インプットDNAの質が悪い ゲル電気泳動、またはBioanalyzerのトレースで DNAが断片化されていないことを確認する インプットDNAの量が不十分 QubitまたはPicogreenを用いて定量を行う （DNA希釈前の定量がより正確） ビーズ精製時のサンプルの消失 Best Practicesの手法にしたがってビーズ精製を行う サーマルサイクラーの蓋が加熱さ サーマルサイクラーが室温以上に加熱される時は、 れていない 蓋の温度を100℃にする 不完全な Fragmentation Fragm
Slide 30: ピークの消失: TruSeq Small RNA
ピークの消失: TruSeq Small RNA Small RNA由来の145-160 bpの ピークが見られない。 本キットによりSmall RNAが回収されなかった。 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ 消失 のピーク のピーク 30
Slide 31: ピークの消失: TruSeq Small RNA
ピークの消失: TruSeq Small RNA 18S 28S Small RNA由来の145-160 bpのピークが見られない。 本キットによりSmall RNAが回収されなかった。 RNA input 考えられる原因 対策 質の低いインプットRNA RIN8以上のRNAサンプルを使用する 精製したRNA中にSmall RNAが存在しない Small RNAの精製に対応したキットを使用する アダプターオリゴの二次構造の形成 70℃で温めた直後に氷上に移す 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ 消失 のピーク のピーク 31
Slide 32: ピークの消失: Nextera libraries
ピークの消失: Nextera libraries 考えられる原因 対策 インプットDNAの質が悪い ゲル電気泳動、またはBioanalyzerのトレースで DNAが断片化されていないことを確認する インプットDNAの量が不十分 QubitまたはPicogreenを用いて定量を行う （DNA希釈前の定量がより正確） ビーズ精製時のサンプルの消失 Best Practicesの手法にしたがってビーズ精製を行う PCR時に誤ったプライマーを 使用予定のインデックス付アダプターが、 使用してしまった 適切なキットのものであることを確認する 酵素の劣化 酵素を消費期限内に使用する。 凍結融解を繰り返さ
Slide 33: For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
目的外の 目的外の 期待される結 期待と異なる ピークの消失 大きなサイズ 小さなサイズ 果 サイズ のピーク のピーク For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 33
Slide 34: 目的外の大きなサイズのピーク: AMPure beadsの持ち込み
目的外の大きなサイズのピーク AMPure beadsの持ち込み ビーズのキャリーオーバー 考えられる原因 対策 ライブラリーの回収時に ライブラリーが透明になるまで磁石の上に静置したのち、 ビーズが混入した Best Practicesの手法にしたがってビーズ精製を行う （ビーズのキャリーオーバー） 目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ 消失 のピーク のピーク 34
Slide 35: 目的外の大きなサイズのピーク: PCR artifacts
目的外の大きなサイズのピーク PCR artifacts PCRのアーチファクト （Bubble product） 1) サンプルの一部を 95℃、5分間加熱したのち、ヒートブロック中でゆっくり室温に戻す または、2) サンプルの一部をtemplateとして1～2サイクルのPCRにかけた場合に ピークが1つになれば Bubble productであることが確認できる。 Bubble product が生じた場合には、qPCR による定量がお勧め。 考えられる原因 対策 インプットするサンプル量が多すぎる インプットするサンプル量を減らす （PCR反応に必要な試薬が枯渇） PCRのcycle数が
Slide 36: For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
目的外の 目的外の 期待される 期待と異なる ピークの消失 大きなサイズ 小さなサイズ 結果 サイズ のピーク のピーク For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 36
Slide 37: 目的外の小さなサイズのピーク: TruSeq libraries
目的外の小さなサイズのピーク: TruSeq libraries アダプターダイマー 考えられる原因 対策 インプットDNA Qubitまたは ~120bp の量が不十分 Picogreenを用い て定量を行う ビーズ精製が Best Practicesの 不十分 手法にしたがって ビーズ精製を行う 末端修飾、 試薬を消費期限内 または3’ 末端の に使用する アデニル化の失敗 PCRの温度調整が 正確かを確認 Heat inactivation A-tailing後に70℃ ステップを行わな でインキュベート かった する アダプターダイマー アダプターダイマーはフローセル上でクラスターを形
Slide 38: 目的外の小さなサイズのピーク: Nextera libraries
目的外の小さなサイズのピーク: Nextera libraries プライマーダイマー 考えられる原因 対策 インプットDNA Qubitまたは の量が不十分 Picogreenを用いて 定量を行う <100bp ビーズ精製が Best Practicesの手法に 不十分 したがって ビーズ精製を行う タグメンテーション タグメンテーションの が不十分 ステップで、 正しい時間と温度で タグメンテーション を行う プライマーダイマー プライマーダイマーには完全なアダプター配列が含まれていないため、 クラスターを形成したり、SBSケミストリーを行ったりすることはできない。 しかし、定量に影響を与
Slide 39: TruSeq DNA & RNAのトラブルシューティング
TruSeq DNA & RNAのトラブルシューティング ウェビナー録画 トラブルシューティング編 - TruSeq DNA & RNAキットを用いたライ ブラリー作製におけるトラブルシューティング【イルミナiSchool】 https://jp.illumina.com/events/webinar/archive/webinar_150320_j.html For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 39
Slide 40: 定量定性まとめ - DNA kits
定量定性まとめ - DNA kits Kits 定量 定性 TruSeq Nano DNA Fluorometric Method or qPCR BioAnalyzer or Fragment Analyzer TruSeq PCR Free qPCR BioAnalyzer or Fragment Analyzer Nextera DNA Flex Fluorometric Method (QuBit/PicoGreen) BioAnalyzer or Fragment Analyzer BioAnalyzer (Needed when using Fluorometric Fluorom
Slide 41: 定量定性まとめ - RNA kits
定量定性まとめ - RNA kits Kits 定量 定性 TruSeq RNA v2 qPCR BioAnalyzer or Fragment Analyzer TruSeq Stranded qPCR BioAnalyzer or Fragment Analyzer mRNA TruSeq Stranded Total qPCR BioAnalyzer or Fragment Analyzer RNA TruSeq RNA Exome qPCR/Fluorometric Method BioAnalyzer or Fragment Analyzer TruSight RNA Pan- qP
Slide 42: まとめ
まとめ • 理想的なトレースの条件 期待される ベースラインが平ら、X軸がbpで指定、Markerのピークが確認できる 結果 • ライブラリーのオーバーロード → 希釈し再解析 期待と異なる • ビーズ精製時のミス（T）、タグメンテーションの反応時間（N）が合っていない サイズ → ライブラリーはシーケンス可能。 • インプットDNA/RNAの量・質に問題、調製時にサンプルが消失した可能性 ピークの消失 → シーケンス不可。ライブラリーを再度調製する必要がある。 • AMPure XP ビーズの混入、PCR アーチファクト 目的外の 大きなサイズ → ライブラリーはシーケンス可能。 のピーク
Slide 43: ご清聴ありがとうございました
ご清聴ありがとうございました 43 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 44: Additional Resources
Additional Resources ● Nextera Troubleshooting Guide ● TruSeq Sample Preparation Best Practices and Troubleshooting Guide ● Bulletin Board - DNA/RNA isolation considerations for Illumina Library Preparation Kits - How to thaw and store sequencing reagents for optimal performance - How to achieve mor