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Illumina — Technical Presentation (May 2023)

57 slides from Illumina's technical presentation, May 31, 2023

  1. Slide 1: Sequencing Analysis Viewer（SAV）の使用法

    ラン結果の見方がわかる！ Sequencing Analysis Viewer（SAV） の使用法 岩崎 万由子 テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2023年5月31日 M-JP-00127 © 2023 Illumina, Inc. All rights reserved.

  2. Slide 2: Agenda

    Agenda 1 Sequencing Analysis Viewerのご紹介 2 基本的な操作方法 3 各ランメトリクスの解説と確認方法 4 イルミナシーケンサーの仕様値 5 その他リソース情報 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 2

  3. Slide 3: Sequencing Analysis Viewerのご紹介

    Sequencing Analysis Viewerのご紹介 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  4. Slide 4: Sequencing Analysis Viewer（SAV）とは？

    Sequencing Analysis Viewer（SAV）とは？ - Sequencing Analysis Viewer（SAV） は、 イルミナ次世代シーケンサーのランメトリクスを可視化するソフトウェアです - 配列情報などを参照する機能はなく、ランのクオリティを評価するためのものです For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 4

  5. Slide 5: SAVのダウンロードとバージョンについて

    SAVのダウンロードとバージョンについて イルミナ社のウェブサイトからダウンロードが可能です 詳細なインストール要件は、各バージョンのSoftware GuideまたはProduct Documentationをご確認ください - v2.4.7（Windows対応） iSeq™ 100、MiSeq™、MiniSeq™、NextSeq™ 500/550/1000/2000、NovaSeq™ 6000のデータに対応 （NextSeq 1000/2000 Control Software v1.5以降のデータに非対応） - v2.5.12（Windows対応） NextSeq 1000/2000 C

  6. Slide 6: SAV version 3.0のご紹介

    SAV version 3.0のご紹介 2023年3月に、デザインが一新されたSAV version 3.0がリリースされました - Windowsに加え、MacOS・Linuxに対応したバージョンも登場 - NovaSeq Xのランデータに対応 - version 2がインストールされているコンピューターに、並行してインストールが可能 *version 2.xと3.0で、確認できる主要メトリクスに大きな違いはありません *version 3.0は、データ参照用のファイルパスが半角英数字である必要があります version 2.4 version 3.0 For Research Use On

  7. Slide 7: シーケンサーごとにカスタマイズされた表示メトリクス

    シーケンサーごとにカスタマイズされた表示メトリクス iSeq 100 MiSeq MiniSeq NextSeq 500/550 NextSeq 1000/2000 NovaSeq 6000 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 7

  8. Slide 8: 基本的な操作方法

    BEA A TSER TE FI illumina

  9. Slide 9: SAVでデータを参照するために必要なファイル

    SAVでデータを参照するために必要なファイル 必要なファイル: - InterOpフォルダ全体 - RunInfo.xml - RunParameters.xml - Thumbnail_Imagesフォルダ（オプション）:クラスターの画像を見ることができます （Thumbnailフォルダは、機種によっては存在しません） 必要なファイルの入手先（個人のPC上のSAVの場合）: - Run folder内（ランを実施した日付や装置シリアル番号の入ったフォルダ） - BaseSpace Sequence Hub（BSSH）からダウンロード（p.10参照） *装置上のSAVでは、Outputフォルダ

  10. Slide 10: BaseSpace Sequence HubからSAV参照に必要なファイルをダウンロードする方法

    BaseSpace™ Sequence Hub からSAV参照に必要なファイルをダウンロードする方法 - RUNSタブより該当ランをクリックし、FlLEにあるDownloadからSAVを選択しダウンロードします 1 2 3 4 5 初回はBaseSpase Downloaderが インストールされます 6 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 10

  11. Slide 11: ファイルの開き方

    ファイルの開き方 - 「Browse」からInterOp、RunInfo、RunParametersが入っているフォルダを選択します version 2.4 version 3.0 1 1 2 2 v3.0でフォルダを開けない場合 ファイルパスが半角英数字のみ になっているかご確認ください 3 （例）〇D:¥Run data ×D:¥ランデータ 3 11 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  12. Slide 12: 各タブの解説 [Analysis/Chartsタブ]

    各タブの解説 [Analysis/Chartsタブ] - フローセルのタイルやサイクル、Laneごとの各メトリクスを、チャートで確認できます version 2.4 Analysisタブ version 3.0 Chartsタブ For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 12

  13. Slide 13: 各タブの解説 [Imagingタブ]

    各タブの解説 [Imagingタブ] - サイクル、タイルごとに、各メトリクスの具体的な数値を確認できます - Browseで指定したフォルダ内の適切なLocationにThumbnail_Images（*）のデータがある場合、 クラスターの様子をサムネイル画像で見ることができます version 2.4 version 3.0 サムネイル画像 （*）Thumbnail_Imagesは、機種によっては存在しません For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 13

  14. Slide 14: 各タブの解説 [Summary/Metricsタブ]

    各タブの解説 [Summary/Metricsタブ] - Read、Laneごとに要約された、主要なランメトリクスを確認できます - Read2（i）などの「（i）」がつくReadは、Indexを示します version 2.4 Summaryタブ version 3.0 Metricsタブ For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 14

  15. Slide 15: 各タブの解説 [Indexing/Indexesタブ]

    各タブの解説 [Indexing/Indexesタブ] - Indexタブは、 InterOpフォルダ内にIndexMetricsOut.binが存在する場合のみ表示されます - Index情報に基づき、サンプルごとのおおよそのリードの割合を確認できます version 2.4 Indexingタブ version 3.0 Indexesタブ *NextSeq 1000/2000では、IndexMetricsOut.binがRun folder中のInterOpフォルダ内に自動生成されません。Local DRAGEN analysis モードご利用の場合は、 IndexMetricsOut.b

  16. Slide 16: Overviewタブ（v3.0以降のみ）

    Overviewタブ（v3.0以降のみ） - 主要なランメトリクスの数値とグラフを確認できます For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 16

  17. Slide 17: 各ランメトリクスの解説と確認方法

    各ランメトリクスの解説と確認方法 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  18. Slide 18: ランメトリクス

    ランメトリクス 1 データ収量 5 FWHM 2 クオリティ（%≧Q30） 6 %Base 3 クラスター密度と%Passing Filter（%PF） 7 Phasing / Prephasing 4 Intensity 8 %AlignedとError Rate For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 18

  19. Slide 19: ランメトリクス

    ランメトリクス 1 データ収量 5 FWHM 2 クオリティ（%≧Q30） 6 %Base 3 クラスター密度と%Passing Filter（%PF） 7 Phasing / Prephasing 4 Intensity 8 %AlignedとError Rate For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 19

  20. Slide 20: データ収量とは？

    データ収量とは？ - データ収量（Yield）は、コールされた塩基数（b）で、フィルター（p.28参照）を通過した塩基のみカウントされます - SummaryタブのRun SummaryまたはOverviewタブから、データ収量を確認することができます version 2.4 version 3.0 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 20

  21. Slide 21: ランメトリクス

    ランメトリクス 1 データ収量 5 FWHM 2 クオリティ（%≧Q30） 6 %Base 3 クラスター密度と%Passing Filter（%PF） 7 Phasing / Prephasing 4 Intensity 8 %AlignedとError Rate For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 21

  22. Slide 22: クオリティスコアとは？

    クオリティスコアとは？ - クオリティスコアとは、 Phredスケールに基づいた、ベースコールの正確性の指標です - クオリティスコアは、25サイクル後にフィルター（p.28参照）を通過したクラスターに対してのみ計算されます 塩基が誤ってコールされる ベースコールの Phred Quality Score 確率 正確性 10 10分の1 90% 20 100分の1 99% 30 1000分の1 99.9% %≧Q30 40 10000分の1 99.99% - イルミナシーケンサーでは、クオリティスコアが30以上の塩基の割合（%≧Q30）を仕様値として採用しています - %≧Q30は、99.9%

  23. Slide 23: %≧Q30の確認方法と例

    %≧Q30の確認方法と例 - SummaryタブのRun SummaryまたはOverviewタブから、ラン全体の%≧Q30を見ることができます version 2.4 version 3.0 4.32% 「%≧Q30が95.68%」とはどういう意味？ 99.9%以上の 正確性！ ラン全体でコールされた塩基のうち95.68%が 99.9%以上の正確性でコールされている 95.68% For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 23

  24. Slide 24: サイクルごとの%≧Q30

    サイクルごとの%≧Q30 - Analysis/ChartsタブのData By Cycleから、サイクルごとの%≧Q30を見ることができます - 通常、サイクルが進むにつれて%≧Q30は低下していきます version 2.4 version 3.0 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 24

  25. Slide 25: その他 クオリティスコアの確認方法

    その他 クオリティスコアの確認方法 - Analysis/Chartsタブから、タイルごとの%≧Q30や、クオリティスコアの分布、 サイクルごとのクオリティスコアのヒートマップを確認することができます version 2.4 version 3.0 1 2 1 2 3 3 ① フローセルのタイルごとの%≧Q30 ② クオリティスコアの分布 ③ サイクルごとのクオリティスコアのヒートマップ 25 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  26. Slide 26: ランメトリクス

    ランメトリクス 1 データ収量 5 FWHM 2 クオリティ（%≧Q30） 6 %Base 3 クラスター密度と%Passing Filter（%PF） 7 Phasing / Prephasing 4 Intensity 8 %AlignedとError Rate For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 26

  27. Slide 27: クラスター密度とは？

    クラスター密度とは？ - シーケンス中には、ライブラリーがフローセルの表面上で増幅されます - フローセル表面上で増幅した、1分子由来のライブラリーの束を「クラスター」といいます - フローセルには、クラスターがランダムな位置で形成される「ランダムフローセル」と、 クラスターの位置がウェルで固定された「パターン化フローセル」の2タイプがあります ランダムフローセル パターン化フローセル クラスター =1分子由来のライブラリーの束 ウェル MiSeq, MiniSeq, NextSeq 500/550 iSeq 100, NextSeq 1000/2000, NovaSeq 6000/X ランダ

  28. Slide 28: %Passing Filter（%PF）とは？

    %Passing Filter（%PF）とは？ - シーケンス中にクラスターを、シグナルの純度によってフィルタリングしており、 Read1の25サイクル目までのデータから、シグナルの純度が低いクラスターを除いています - このフィルターをパスしたクラスターの割合が%Passing Filter（%PF）となります - データ収量や%≧Q30は、フィルターを通ったクラスターからのみ計算されます クラスター Underclustering 最適な密度 Overclustering %PFの低下 クラスター フィルターを通過する フィルタリングで除去される クラスター密度が高すぎる場合、クラスターが

  29. Slide 29: ランダムフローセル装置の推奨クラスター密度

    ランダムフローセル装置の推奨クラスター密度 - PhiXコントロールライブラリーのような、塩基多様性が高いライブラリーを想定した推奨値です - 推奨より高いクラスター密度は、%PFの低下につながります その場合は、%PFを上げるために、次のランでローディング濃度（pM）を下げることをご検討ください - PCRアンプリコンのように塩基多様性が低いライブラリーは、クラスター密度を推奨の6～8割程度に 下げることをおすすめしています 推奨クラスター密度 シーケンス試薬 （K/mm2） NextSeq 500/550 Mid/High Output 170-220 MiniSeq Mid/High O

  30. Slide 30: クラスター密度と%PFの確認方法①

    クラスター密度と%PFの確認方法① - Summary/Metricsタブから、Laneごとのクラスター密度（=Density）と%PFを見ることができます version 2.4 version 3.0 99.9%以上の 正確性！ 30 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  31. Slide 31: クラスター密度と%PFの確認方法②

    クラスター密度と%PFの確認方法② - Analysis/Chartsタブから、フローセルのタイルごとのクラスター密度と%PFをチャートで見ることができます version 2.4 version 3.0 99.9%以上の 正確性！ 31 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  32. Slide 32: パターン化フローセルの場合 - %PF vs %Occupied ①

    パターン化フローセルの場合 - %PF vs %Occupied ① - パターン化フローセルでは、固定のウェルにクラスターが形成されるためクラスター密度は固定値です - %Occupiedとは全ウェル数のうち、クラスターが形成されたウェル数の割合を示します - %PFと%Occupiedのプロットから、ライブラリーのローディング濃度が適切かどうか、チェックすることができます *NextSeq 1000/2000では、ローディング濃度最適化の判断に %PFと%Occupiedのプロット作成法 %Loading Concentrationの値もご参照ください version 2.4 versio

  33. Slide 33: パターン化フローセルの場合 - %PF vs %Occupied ②

    パターン化フローセルの場合 - %PF vs %Occupied ② %PFと%Occupiedのプロット作成法 - X軸とY軸のスケールを0～100に合わせることで、よりプロットが見やすくなります version 2.4 version 3.0 ③プロットの軸を右クリックし、 Propertiesを選択 ③プロットの軸を右クリックし、 Manual scaleを選択 ④ X・Yそれぞれに0/100を入力し、 ④「Axes」のX・Yそれぞれに Update scaleをクリック 0/100を入力しOKをクリック 33 For Research Use Only. Not for use in

  34. Slide 34: パターン化フローセルの場合 - %PF vs %Occupied ③

    パターン化フローセルの場合 - %PF vs %Occupied ③ %PFと%Occupiedのプロットの見方 Underloaded 最適なローディング濃度の場合 Overloaded %Occupied %Occupied 右上がりの直線状 一箇所にまとまったプロット 垂直に近い右下がり %Occupiedは90%後半 参考ページ:「Cluster Optimization Overview」 https://jp.support.illumina.com/downloads/cluster-optimization-overview-guide-1000000071511.html 3

  35. Slide 35: ランメトリクス

    ランメトリクス 1 データ収量 5 FWHM 2 クオリティ（%≧Q30） 6 %Base 3 クラスター密度と%Passing Filter（%PF） 7 Phasing / Prephasing 4 Intensity 8 %AlignedとError Rate For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 35

  36. Slide 36: Intensityとは？

    Intensityとは？ - 装置ごとに、4・2・1色の蛍光色素で塩基が標識されており、各蛍光の強度をIntensityといいます - フィルターをパスしたクラスターのみ、Intensityが計算されています 4色法 2色法 1色法 MiniSeq、NextSeq 500/550、 MiSeq NextSeq 1000/2000、 iSeq 100 NovaSeq 6000 参考資料：「イルミナ 2 色法 SBS シーケンステクノロジー」 「イルミナCMOS Chipおよび1色法SBSケミストリー」 36 For Research Use Only. Not for use in diagno

  37. Slide 37: Intensityの確認方法

    Intensityの確認方法 - Analysis/ChartsタブのData By Cycleから、サイクルごとのIntensityを見ることができます version 2.4 （例）MiSeq・4色法の場合 version 3.0 （例）NextSeq 550・2色法の場合 37 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  38. Slide 38: ランメトリクス

    ランメトリクス 1 データ収量 5 FWHM 2 クオリティ（%≧Q30） 6 %Base 3 クラスター密度と%Passing Filter（%PF） 7 Phasing / Prephasing 4 Intensity 8 %AlignedとError Rate For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 38

  39. Slide 39: FWHMとは？

    FWHMとは？ - FWHM（Full Width Half Maximum）とは、Intensityが最大値の半分の値をとる時のクラスターの幅を示す値で、 フォーカス精度に関連する指標となります - ライブラリーの塩基多様性に影響を受けて、波形に乱れが生じることもあります Analysis/ChartsタブのData By Cycleから、サイクルごとのFWHMを見ることができます Intensity FWHM 最大値 2分の1 Position 正常なラン 波形に乱れのあるラン For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedu

  40. Slide 40: ランメトリクス

    ランメトリクス 1 データ収量 5 FWHM 2 クオリティ（%≧Q30） 6 %Base 3 クラスター密度と%Passing Filter（%PF） 7 Phasing / Prephasing 4 Intensity 8 %AlignedとError Rate For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 40

  41. Slide 41: %Baseとは？

    %Baseとは？ - 各サイクルでコールされた塩基のうち、A/C/G/Tの塩基が占める各割合を%Baseといい、 ライブラリーの塩基多様性の確認に役立ちます Analysis/ChartsタブのData By Cycleから、サイクルごとの%Baseを見ることができます 塩基多様性の高いライブラリー （例）Whole Genome Sequence 塩基多様性の低いライブラリー （例）PCRアンプリコン ランを通してA/C/G/Tの割合が同程度 サイクルごとの塩基の偏りが大きい 41 For Research Use Only. Not for use in diagnostic proced

  42. Slide 42: ランメトリクス

    ランメトリクス 1 データ収量 5 FWHM 2 クオリティ（%≧Q30） 6 %Base 3 クラスター密度と%Passing Filter（%PF） 7 Phasing / Prephasing 4 Intensity 8 %AlignedとError Rate For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 42

  43. Slide 43: PhasingとPrephasingとは？

    PhasingとPrephasingとは？ - シーケンス反応では1サイクルごとに、1塩基の伸長・塩基の読み取りが行われます - Phasingは、クラスター内の一部のライブラリー分子の一塩基伸長反応が遅れたときに、 Prephasingは、一塩基伸長反応が進みすぎたときに発生します Phasing/Prephasing率が高くなる原因の例 • 不適切な室温 • 装置の温度制御系のトラブル • 装置のWashが不十分 • シーケンス試薬の期限切れ 43 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  44. Slide 44: Phasing/Prephasing率の確認方法

    Phasing/Prephasing率の確認方法 - Summary/Metricsタブから、Laneごと・Readごとの「Legacy Phasing/Prephasing Rate」から Phasing/Prephasing率を見ることができます - Phasing/Prephasing率は、各Readの25サイクル目時点で算出される推定値です version 2.4 version 3.0 44 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  45. Slide 45: ランメトリクス

    ランメトリクス 1 データ収量 5 FWHM 2 クオリティ（%≧Q30） 6 %Base 3 クラスター密度と%Passing Filter（%PF） 7 Phasing / Prephasing 4 Intensity 8 %AlignedとError Rate For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 45

  46. Slide 46: PhiXに関するメトリクス - %AlignedとError Rate

    PhiXに関するメトリクス - %AlignedとError Rate - PhiXとはコントロールライブラリーであり、通常は2%程度、塩基多様性が低い場合は20%以上やそれ以上の 割合でスパイクインいただくことをおすすめしています - 「%Aligned」と「Error Rate」は、PhiXコントロールライブラリーをスパイクインした場合のみ表示される数値です %Aligned - フィルターをパスしたクラスターのうち、PhiXゲノムにアライメントされたリードの割合 （例）PhiXコンロトロールライブラリーをモル比で25%スパイクインした場合、 %Alignedは25%に近い値をとることが期

  47. Slide 47: %AlignedとError Rateの確認方法

    %AlignedとError Rateの確認方法 - Summary/Metricsタブから、Readごとの%AlignedとError Rateを見ることができます version 2.4 version 3.0 PhiXコントロールライブラリーにはIndex配列がないため、 Indexリードの%Alignedは0になり Error Rateは計算されません（NaNと表記されます） For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 47

  48. Slide 48: イルミナシーケンサーの仕様値

    イルミナシーケンサーの仕様値 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  49. Slide 49: イルミナの仕様と確認方法① - データ収量とクオリティスコア

    イルミナの仕様と確認方法① - データ収量とクオリティスコア - イルミナシーケンサーには、「データ収量」と「クオリティスコア」の2つのメトリクスについて ラン試薬ごと・ラン条件ごとに仕様値があります（PhiXコントロールライブラリーに基づいた値です） - 各装置における仕様は、イルミナ社ウェブサイトの製品ページからご確認いただけます （例）MiSeq Reagent Kit v3, 2 x 300 cycleのランの場合 *2023年5月時点の情報です イルミナ社ウェブサイト 49 For Research Use Only. Not for use in diagnostic proced

  50. Slide 50: イルミナの仕様と確認方法② - データ収量とクオリティスコア

    イルミナの仕様と確認方法② - データ収量とクオリティスコア （例）MiSeq Reagent Kit v3, 2 x 300 cycleのランの場合 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 50

  51. Slide 51: イルミナの仕様と確認方法③ - データ収量とクオリティスコア

    イルミナの仕様と確認方法③ - データ収量とクオリティスコア （例）MiSeq Reagent Kit v3, 2 x 300 cycleのランの場合 • データ出力（収量）：13.2～15 Gb • クオリティスコア（Average）：%≧Q30が70%以上 が仕様値となります 51 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  52. Slide 52: 装置別 %≧Q30の仕様値（PhiXコントロールの場合）

    装置別 %≧Q30の仕様値（PhiXコントロールの場合） 1x36 1x50 1x75 1x100 2x25 2x50 2x75 2x100 2x150 2x250 2x300 bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp NovaSeq X ≧90% ≧85% ≧85% NovaSeq 6000 ≧90%* ≧90% ≧85% ≧85% ≧75% NextSeq ≧90% ≧90% ≧85% ≧85% ≧80% 1000/2000 NextSeq ≧80% ≧80% ≧75% 500/550 MiniSeq ≧85% ≧85% ≧85% ≧80% MiSeq ≧90% ≧

  53. Slide 53: その他リソース情報

    その他リソース情報 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  54. Slide 54: SAV全般の関連リンク

    SAV全般の関連リンク - Sequencing Analysis Viewer（SAV）ガイド https://jp.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/sequencing_analysis_viewer_sav/documentation.html - Sequencing Analysis Viewer（SAV）ダウンロードページ https://jp.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/sequencing_analysis_viewer_sav/d

  55. Slide 55: Analysis/Chartsタブ 活用のヒント

    Appendix Analysis/Chartsタブ 活用のヒント version 2.4 1 version 3.0 2 3 3 1 4 2 4 ① 右上のアイコンをクリックすると、チャートを拡大することができます ② チャートの縮尺を固定することができます ③ チャートの軸をスクロールすると、縮尺を変更することができます 変更した縮尺は、チャートを右クリックし「Auto-Scale Axes/Reset zoom」でデフォルトに戻ります ④ チャートを右クリックし「Copy To Clipboard」で、クリップボードにイメージをコピーできます For Research Use Only.

  56. Slide 56: Imagingタブ 活用のヒント

    Appendix Imagingタブ 活用のヒント version 2.4 すべて テーブルを .txt ファ 散布図/ イルにエクスポート 箱ひげ図を フィルターの設定/ の行を 作成する フィルターをクリア 選択 する 昇順/降順/カスタムで 選択した 列を並べ替える 表示する列を選択 選択行を移動（キーボードでも可） 行をクリッ V3.0では各列タイトルを選択 プボードに （カスタムは不可） コピー version 3.0 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 56

  57. Slide 57: ご清聴ありがとうございました

    ご清聴ありがとうございました 岩崎 万由子 2023.05.31| techsupport@illumina.com

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