Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (October 2018)
39 slides from Illumina's technical presentation, Oct 31, 2018
Slide 1: 進化したNextera DNA Flexを用いたライブラリー調製
進化したNextera DNA Flexを用いたライブラリー調製 フィールドアプリケーションサイエンティスト 大出 明 2018/10/31 © 2016 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cBot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, ForenSeq, Genetic Energy, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq,
Slide 2: Nextera DNA Flexライブラリー調製ワークフロー
Nextera DNA Flexライブラリー調製ワークフロー 1. Nextera DNA Flexライブラリー調製キットの紹介 2. DNA試料の準備 - 注意点、必要量、品質確認 3. ライブラリー調製 - 関連製品および準備品 - Nextera DNA Flex調製方法 4. ライブラリー評価、シークエンス条件 - ライブラリーの定量と定性 - ローディングDNA濃度、リード長 5. まとめ - ライブラリー調製のポイント - トラブルシュート 2 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 3: イルミナDNAライブラリー調製キット
イルミナDNAライブラリー調製キット 酵素による断片化 機械による断片化 Nextera DNA Flex TruSeq Nano 高 高性能 / 速い + 簡単 高性能 性能 Nextera XT 中 速い + 簡単 容易 複雑 ワークフロー 3 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 4: DNAライブラリー調製法の課題
DNAライブラリー調製法の課題 全ゲノムライブラリー調製 課題 物理的DNA断片化 酵素法DNA断片化 DNA試料の調製 ライブラリーQC (TruSeq法) （従来のNextera法） DNA抽出、 断片化装置が必要、 定量、サイズ確認 切断時のbiasの影響 精製、定量 煩雑な作業 ノーマライゼーション 解決策 Nextera™ DNA Flex Library Prep Kit 多様なサンプルから、素早く、高品質なライブラリを簡便に調製できる 4 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 5: 多様なサンプルに対応
多様なサンプルに対応 ゲノムDNA、血液、唾液、微生物 gDNA 血液* 血液パンチカード 唾液** 微生物コロニー 1 – 500 ng DNAから 10 ulの非凍結全血から 5 x 3 mm2のDBS card 30 ulの熱処理済み唾液 白金耳で採取した10 uL 調整可能 調製可能 から調製可能 から調製可能 の培地から調製可能 *Flex Lysis Reagent Kit 検証済みプロトコールを **Oragene Saliva 検証済みプロトコールを と組み合わせて利用 サポートページで公開 Collection Kit サポートページで公開 と組み合わせて利用 DNA抽出後の
Slide 6: 酵素法DNA断片化を利用したライブラリー調製
酵素法DNA断片化を利用したライブラリー調製 Nextera XTの場合 Nextera改変型トランスポゾン ゲノムDNA ~ 300塩基 タグメンテーション （トランスポゾンによる断片化） PCR増幅 P5配列 インデックス配列1 インデックス配列2 P7配列 MiSeqで解析可能なDNA断片（ライブラリ） 6 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 7: Nextera DNA Flex Library Prep ワークフローの概要
Nextera™ DNA Flex Library Prep ワークフローの概要 DNAを単離、精製 DNAとBLTを混合 DNAの切断、タグメンテーション ビーズ結合トランスポソーム（BLT） 1-500 ngのDNA 平均300-350 bpのサイズに切断 PCRでイルミナアダプターを付加 磁気ビーズによる精製後、ライブラリーの完成 7 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 8: イルミナDNAライブラリー調製キットの比較
イルミナDNAライブラリー調製キットの比較 Nextera DNA Flex TruSeq Nextera 体液 Large Genome ※ Nano XT 血液、唾液、 DNA DNA DNA DNA 出発材料 微生物コロニー < 100 ng 100 - 500 ng 100 - 200 ng 1 ng DNA試料の 不要 必要 不要 必要 必要 定量 断片化装置 不要 不要 不要 必要 不要 ノーマライゼーション 試料状況次第 不要 不要 必要 必要 ライブラリー 350 bp 300 - 350 bp < 300 bp インサートサイズ 550 bp ライブラリDNAの 試料状況次第
Slide 9: BLTを使用したタグメンテーションの利点
BLTを使用したタグメンテーションの利点 安定したインサートサイズとライブラリー収量 幅広いDNA使用量に対して、 十分なDNA使用量において、 均質なインサートサイズを実現 一定のライブラリー収量を実現 1～500ng gDNA使用 100～500ng gDNA使用 血液、唾液、乾燥血液、 細菌コロニーのプロトコール使用時 DNA試料の厳密な定量、および ライブラリー調整後のノーマライゼーションが不要に 9 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 10: 性能比較 Small Genome：バクテリアゲノムカバー率
性能比較 Small Genome バクテリアゲノムカバー率 A.baumannii のゲノムカバレッジプロファイル (GC含量=39%) Nextera Nextera TruSeq 15.0% DNA XT Nano Newtera Nextera DNA Flex Flex ゲノムカバー率 10.0% Nextera Nextera XT カバレッジ標準偏差 2.8 3.2 2.9 TruSeq Truseq Nano Nano ゲノム非カバー率 0.3% 1.8% 0.2% 5.0% 0.0% ゲノムカバー率（＜3x） 5.5% 10.0% 4.0% 0 2 4 6 8 10 12 1
Slide 11: 性能比較 Small Genome：カバレッジの均一性
性能比較 Small Genome カバレッジの均一性 GC含量＝32.8% → GC contents ゲノムカバレッジ → Nextera XT (1 ng) → Nextera DNA Flex (1 ng) → Nextera DNA Flex (200 ng) ゲノム位置 GC含量＝66.5% ゲノムカバレッジ ゲノム位置 Nextera DNA Flexは、高ATおよび高GCのゲノムDNAでも、 均一なカバレッジを得ることが可能 11 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 12: 性能比較 Small Genome：コンティグ長の比較
性能比較 Small Genome コンティグ長の比較 Nextera DNA Flexは、高ATおよび高GCのゲノムDNAでも、 長いコンティグを得ることが可能 12 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 13: 性能比較 ヒトゲノム
性能比較 ヒトゲノム ゲノムカバー率 ヒト全ゲノムのカバレッジの均一性 高ATおよび高GC領域のカバレッジ Nextera DNA Flexは、ヒトゲノムの解析においても TruSeq Nanoと同じく良好な結果が得られる 13 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 14: Nextera Flex for Enrichment
☆ Nextera Flex for Enrichment ✓ FFPEを含む様々なサンプルから、簡便かつ迅速に、均質なライブラリーを作 成するための製品です。 ✓ これまでのエクソーム製品やTruSightOneなどのパネル製品だけでなく、 IDTやTwistといった他社製品パネルや濃縮系のカスタム製品も使用することが できます。 製品番号 製品名 希望販売価格 Nextera DNA Flex Pre-Enrichment Library Prep and Enrichment Reagents 20025523 616,000円 16 samples (16, 1-plex enrich
Slide 15: Nextera DNA Flexライブラリー調製ワークフロー
Nextera DNA Flexライブラリー調製ワークフロー 1. Nextera DNA Flexライブラリー調製キットの紹介 2. DNA試料の準備 - 注意点、必要量、品質確認 3. ライブラリー調製 - 関連製品および準備品 - Nextera DNA Flex調製方法 4. ライブラリー評価、シークエンス条件 - ライブラリーの定量と定性 - ローディングDNA濃度、リード長 5. まとめ - ライブラリー調製のポイント - トラブルシュート 15 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 16: DNA試料の準備
DNA試料の準備 ✓ EDTAなどの夾雑物がTagmentation反応を阻害するため、溶出液には、 Nucrease-free Water、または、10 mM Tris-HCl(pH8.5)の使用を推奨。 液量は30 ul必要。 ✓ 抽出したDNAは、分光光度計にて吸光度を測定し、精製度を確認する。 260/280 Ratio：1.8 – 2.0 および 260/230 Ratio：2.0 – 2.2 ✓ 100 – 500 ngのDNA試料を反応に使用する場合は、 厳密な測定は必要ない。 PCR cycle数は一定である。 ✓ 微量のDNA試料(1-100 ng)を反応に使用する場合は、
Slide 17: Nextera DNA Flexライブラリー調製ワークフロー
Nextera DNA Flexライブラリー調製ワークフロー 1. Nextera DNA Flexライブラリー調製キットの紹介 2. DNA試料の準備 - 注意点、必要量、品質確認 3. ライブラリー調製 - 関連製品および準備品 - Nextera DNA Flex調製方法 4. ライブラリー評価、シークエンス条件 - ライブラリーの定量と定性 - ローディングDNA濃度、リード長 5. まとめ - ライブラリー調製のポイント - トラブルシュート 17 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 18: Nextera DNA Flex Library Prep 関連製品
Nextera DNA Flex Library Prep 関連製品 DNA抽出 ライブラリー調製 インデックス Flex Lysis Nextera DNA Flex Nextera DNA CD Reagent Kit Library Prep Index Kit （血液用） カタログ 試料あたりの 製品名 希望販売価格 番号 単価 20018706 Flex Lysis Reagent Kit (96 Samples) 525円 50,400円 20018704 Nextera DNA Flex Library Prep (24 Samples) 7,375円 177,000円 2001
Slide 19: Nextera DNA CD Indexes
Nextera DNA CD Indexes 24パターンのデュアルインデックス 24デュアルインデックスライブラリー チューブフォーマット （4 + 6 index） TruSeq Index Plate Fixture Kit（別売り）が便利 Ⓐ Ⓑ 19 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 20: Nextera DNA CD Indexes
Nextera DNA CD Indexes 96パターンのデュアルインデックス 96デュアルインデックスライブラリー プレートフォーマット （8 x 12 index） 20 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 21: ライブラリー調製 必要準備品
ライブラリー調製 必要準備品 - Nextera DNA Flex Library Prep Box # 略称 名称 保管温度 1 SPB ※ Sample Purification Beads 冷蔵 1 TSB Tagment Stop Buffer 冷蔵→室温 1 TWB Tagment Wash Buffer 冷蔵→室温 2 RSB Resuspension Buffer 冷凍 2 TB1 Tagmentation Buffer 1 冷凍 2 EPM Enhanced PCR Mix 冷凍 3 BLT Bead-Linked Transposomes 冷蔵 ※ Reference gui
Slide 22: ライブラリー調製 必要準備品 - 器具・装置
ライブラリー調製 必要準備品 - 器具・装置 # 製品名 製造販売元 型番 備考 マイクロピペット（シングル） 1 メーカー指定なし 20, 200, 1000 ul マイクロピペット（８連） 2 メーカー指定なし オプション 20, 200 ul 3 96ウェル専用マグネットスタンド Thermo Fisher AM10027 ※1 4 蛍光定量装置 (Qubit Fluorometer 4.0) Thermo Fisher Q33226 同等品可 5 分光光度計 メーカー指定なし 6 電気泳動装置 (Agilent 2100 Bioanalyzer) Agilent G2940CA 同等品
Slide 23: ライブラリー調製 必要準備品 - 試薬・消耗品
ライブラリー調製 必要準備品 - 試薬・消耗品 # 製品名 製造販売元 型番 備考 Ethanol (absolute) 1 Sigma-Aldrich E7023 同等品可 for molecular biology 2 Nuclease-free water メーカー指定なし 96-well storage plates, round well 3 Thermo Fisher AB-0859 ※1、※2 0.8 ml (midi plate) 4 96-well PCRプレート メーカー指定なし サーマルサイクラー推奨品 5 PCRプレートシール(PCR用） メーカー指定なし サーマルサイ
Slide 24: Nextera DNA Flex調製方法
Nextera DNA Flex調製方法 Step 1：DNAの断片化 （1.0時間） → ＋ ↓ Step 2：断片化DNAの精製 （0.3時間） ↓ → → Step 3：断片化DNAの増幅 （1.0時間） ↓ Step 4：ライブラリーの精製 （0.7時間） → → → → → → → → 24 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 25: Nextera DNA Flex / ライブラリー精製のポイント
Nextera DNA Flex / ライブラリー精製のポイント Fragmented gDNA (Blue) ✓ SPBの濃度と回収物に注意 Final Library (Red) 高分子量および低分子量のDNAを 順番に除去しています。 高分子量DNA Primerなど → → → → → → → → ビーズ添加① 上清回収 ビーズ添加② 上清廃棄 DNA溶出 上清回収 ビーズを磁力で固定 ビーズを磁力で固定 ビーズを磁力で固定 高分子量のDNAがビーズに吸着 目的のサイズのDNAがビーズに吸着 目的のサイズのDNAを 目的のDNAが含まれる上清を回収 Primerなどが含まれる上清を廃棄
Slide 26: Step 1：DNAの断片化①
Step 1：DNAの断片化① ① BLT (Bead Linked Transposome)とTB1 (Tagmentation Buffer)の準備 BLT(冷蔵)を室温に戻し、ボルテックスで完全に混和する TB1(冷凍)を室温で融解、ボルテックスで混和・スピンダウン ② Tagmentation Master Mixの作成（１サンプル当たり） BLT (Bead Linked Transposome) 11 µl TB1 (Tagmentation Buffer) 11 µl Total 22 µl、ボルテックスで完全に懸濁する ③ DNA試料とTagmentation Master M
Slide 27: Step 1：DNAの断片化②
Step 1：DNAの断片化② ⑥ TSB (Tagment Stop Buffer)とTWB (Tagment Wash Buffer) の準備 TSB(室温)に沈殿物がある場合は、37℃・10分で溶解、ボルテックスで混和 TWB(室温)は、そのまま室温で静置。 ⑦ TSBの添加 ③の反応液 50 µl TSB (Tagment Stop Buffer) 10 µl Total 60 µl、ピペットで10回、穏やかに懸濁 ⑧ PCRプレートにプレートシール(PCR用)を貼る ⑨ 断片化反応の停止 プログラム名：NF-STOP Lid 温度：100℃ 、Volume：60 µl 37℃, 15
Slide 28: Step 2：断片化DNAの精製
Step 2：断片化DNAの精製 ① PCRプレートをマグネットスタンド上で３分間静置後、上清を廃棄 ② PCRプレートをマグネットスタンドから外す ③ TWBで洗浄する（泡立ちやすいので慎重に） 合計2回 断片化反応後のtube/plate 沈殿磁気ビーズ 洗浄する TWB (Tagment Wash Buffer) 100 µl Total 100 µl、ピペットで10回、穏やかに懸濁 ④ PCRプレートをマグネットスタンド上で３分間静置後、上清を廃棄 ⑤ PCRプレートをマグネットスタンドから外す ⑥ TWBで洗浄する（泡立ちやすいので慎重に） 断片化反応後のtube/plate 沈殿磁
Slide 29: Step 3：断片化DNAの増幅①
Step 3：断片化DNAの増幅① ① EPM (Enhanced PCR Mix)とindex adapterの準備 EPM(冷凍)を氷上で融解し、転倒混和・スピンダウン。氷上に静置。 index adapter(冷凍)を室温で融解、ボルテックスで混和・スピンダウン ② PCR Master Mixの作成（１サンプル当たり） EPM (Enhanced PCR Mix) 22 µl Nuclease-free water 22 µl Total 44 µl、ボルテックス後・スピンダウン ③ PCRプレートをマグネットスタンド上で３分間以上静置後、上清を廃棄 ビーズの乾燥を防ぐため、 ④ P2
Slide 30: Step 3：断片化DNAの増幅②
Step 3：断片化DNAの増幅② ⑦ index adapterの添加 ⑥のtube/plate 沈殿磁気ビーズ ＋ 40 µl 少数(7試料以下)測定の際に使用する i5 adapter 5 µl indexの組み合わせについては、 i7 adapter 5 µl Index Adapters Pooling Guide (part # 1000000041074)をご確認ください Total 50 µl 40 µlに設定したピペットで10回、穏やかに懸濁 ⑧ PCRプレートにプレートシール(PCR用)を貼る DNA使用量(ng) PCR cycle ⑨ 断片化DNAの増幅 1-9 12
Slide 31: Step 4：ライブラリーの精製①
Step 4：ライブラリーの精製① ① SPB(Purification Beads)、RSB (Resuspension Buffer)、80% エタノールの準備 SPB(冷蔵)を室温で30分放置、ボルテックスで完全に懸濁する RSB (冷凍)を室温で融解、ボルテックスで混和・スピンダウン 80% エタノール（１サンプル当たり600ul使用）を作成する ② PCRプレートをスピンダウン後、マグネットスタンド上で５分間静置 ③ マグネットスタンド上のPCRプレートから45 µlの上清をMIDIプレート[a]へ回収 ④ SPB Master Mixの作成（１サンプル当たり） SPB(Purifi
Slide 32: Step 4：ライブラリーの精製②
Step 4：ライブラリーの精製② ⑥ MIDIプレート[a]を実験台上で５分間静置 ⑦ MIDIプレート[a]をマグネットスタンド上で５分間静置 ⑧ よく懸濁したSPB原液を、MIDIプレート[b]へ15 µlずつ分注する ⑨ マグネットスタンド上のMIDIプレート[a]から、上清をMIDIプレート[b]へ分注 MIDIプレート[b] PB 15 µl MIDIプレート[a]の上清 125 µl Total 140 µl、ピペットで10回、穏やかに懸濁 ⑩ MIDIプレート[b]を実験台上で５分間静置 ⑪ MIDIプレート[b]をマグネットスタンド上で５分間静置後、上清を廃棄 ⑫ MIDIプ
Slide 33: Step 4：ライブラリーの精製③
Step 4：ライブラリーの精製③ ⑭ P20のピペットで余分なエタノールを取り除く ⑮ MIDIプレート[b]をマグネットスタンド上で風乾する 実験環境にもよりますが、5分程度を目安に、 ビーズ表面にヒビが入り始めた時点まで。 過度な風乾は溶出効率を低下させます。 ⑯ MIDIプレート[b]をマグネットスタンドから外す ⑰ RSBの添加 MIDIプレート[b] 沈殿磁気ビーズ RSB (Resuspension Buffer) 32 µl Total 32 µl、ピペットで10回、完全に懸濁 ⑱ MIDIプレート[b]を実験台上で２分間静置 ⑲ MIDIプレート[b]をマグネットスタンド上で
Slide 34: Nextera DNA Flexライブラリー調製ワークフロー
Nextera DNA Flexライブラリー調製ワークフロー 1. Nextera DNA Flexライブラリー調製キットの紹介 2. DNA試料の準備 - 注意点、必要量、品質確認 3. ライブラリー調製 - 関連製品および準備品 - Nextera DNA Flex調製方法 4. ライブラリー評価、シークエンス条件 - ライブラリーの定量と定性 - ローディングDNA濃度、リード長 5. まとめ - ライブラリー調製のポイント - トラブルシュート 34 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 35: ライブラリーの評価
ライブラリーの評価 - ライブラリーの定量と定性 ＜定量方法＞ ・蛍光法(QUBITなど)による定量法 期待される収量は、経験的に 10 ng/µl程度となることが多い ・DNA試料(100-500 ng)の場合、等量ずつ新しいtubeに分取(ノーマライズ不要) ・DNA試料(100 ng以下)の場合、サンプル個別に定量し、それぞれ4 nMへ希釈。 等量ずつ新しいtubeに分取 （血液・唾液等の場合は、試料の状態によって収量が変わる場合がある） ＜定性方法＞ ・電気泳動によるサイズ評価 Agilent 2100 Bioanalyzer (DNA1000)等 精製ライブラリーから 1 µl使用
Slide 36: シークエンス条件
シークエンス条件 - ライブラリーの変性 装置ごとに推奨される手順にて、アルカリ変性・希釈を実施 （必要に応じて、PhiX controlを適量Spike-in） - 推奨ローディングDNA濃度 Sequencer 至適クラスター密度 ローディング濃度 Platform (clusters/mm2) (pM) HiSeq X 200 - 300 HiSeq 3000/4000 200 - 300 HiSeq 2000/2500 HO V3 750 - 850K 12 HiSeq 2500 RR V2 850 - 1000K 8.5 NextSeq, MiniSeq 70 - 220K 1.2
Slide 37: Nextera DNA Flexライブラリー調製ワークフロー
Nextera DNA Flexライブラリー調製ワークフロー 1. Nextera DNA Flexライブラリー調製キットの紹介 2. DNA試料の準備 - 注意点、必要量、品質確認 3. ライブラリー調製 - 関連製品および準備品 - Nextera DNA Flex調製方法 4. ライブラリー評価、シークエンス条件 - ライブラリーの定量と定性 - ローディングDNA濃度、リード長 5. まとめ - ライブラリー調製のポイント - トラブルシュート 37 本製品の使用目的は研究に限定されます。 診断での使用はできません。
Slide 38: Nextera DNA Flexライブラリー調製のポイント
Nextera DNA Flexライブラリー調製のポイント ✓ DNA試料の抽出液は、Nucrease-free Water、または、 10 mM Tris-HCl(pH8.5)を推奨。 ✓ DNAの定量および品質確認は、指定された測定法にて実施すること。 ✓ PCRプレート/プレートシールはサーマルサイクラーに適合したもの を使用する。 ✓ BLTおよびSPBは、ビーズが常にバッファー中に存在する状態で、 正立させて冷蔵庫(2-8℃)に保管し、使用前によく懸濁する。 ✓ TSBおよびTWBは、室温(10-30℃)に保管する。 ✓ EPMは冷凍庫(-20℃)に保管し、使用前に氷上で解凍する。
Slide 39: トラブルシュート
トラブルシュート ⚫ ライブラリー収量が極端に少ない場合 ・DNA試料の劣化または不足、BLTの劣化または不足 ・ビーズ精製時のトラブル（洗浄、風乾、回収の工程） ・試薬の添加ミス、反応時間の過不足 ⚫ ライブラリーサイズが異なる場合 ・DNA試料の使用量と品質を確認 ・反応温度・時間の確認 ・ビーズ精製工程の確認 ⚫ プールライブラリーのデータ量がサンプル間で異なる場合 ・DNA試料の劣化または不足、BLTの不足 ・BLT、SPBの懸濁不足 39