Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (March 2018)
67 slides from Illumina's technical presentation, Mar 28, 2018
Slide 1: 「RNA-Seqをはじめよう」シリーズ 情報解析編
イルミナウェビナー 「RNA-Seqをはじめよう」シリーズ 情報解析編 初めての方でも大丈夫、クラウド を用いた簡単クリック情報解析 寺倉 伸治 シニアフィールドアプリケーションサイエンティスト Mar/28/2018 © 2016 Illumina, Inc. All rights reserved.
Slide 2: 「RNA-Seqをはじめよう」シリーズのご案内
イルミナウェビナー 「RNA-Seqをはじめよう」シリーズのご案内 絶対に失敗しない クラウドを用いた これからRNA-Seqを始める方 ライブラリー調製 簡単クリック情報解析 実験デザイン編 ライブラリー調製編 情報解析編 1月31日 2月28日 3月28日 • これからRNA-Seqを • ワークフローはも 始める方に、実験デ ちろん、実験を行 • 解析アプリの実行 ザインをどのように う上での落とし穴、 方法、出力結果の 立てたらよいかの案 ライブラリーの評 紹介行います。 内を行います。 価方法を紹介しま す。 過去のウェビナーは弊社HPで録画・スライドを公表しています。 2 http
Slide 3: 今回のウェビナーの流れ
今回のウェビナーの流れ ● BaseSpace Sequencing Hubの紹介 ● RNA-Seqの情報解析 本ウェビナーで使用したスライドと録画は、およそ一週間後に 弊社HPに過去のウェビナーとしてアップロードされます。 https://jp.illumina.com/events/webinar.html 3
Slide 4: BaseSpace Sequencing Hubの紹介
BaseSpace Sequencing Hubの紹介 4
Slide 5: BaseSpace Sequence Hub 概念図
BaseSpace Sequence Hub 概念図 配列データ、解析データの保存・共有・譲渡 所有または共有された データを データを使用して BaseSpace Hubに アプリを実行 アップロード 配列データ、解析データの 保存、共有、 所有データの譲渡 ラン・解析データの管理 データの共有 クリックによる解析が可能 5
Slide 6: BaseSpace で提供されているアプリケーション
BaseSpace で提供されているアプリケーション 全ゲノムシーケンス ターゲットシーケンス トランスクリプトーム Methyl-Seq メタゲノム解析 バクテリア de novo アセンブル その他 BaseSpaceアプリクイックガイド http://jp.illumina.com/content/dam/illumina- marketing/documents/applications/basespace/basespace-apps-quick-guide.pdf 6
Slide 7: BaseSpace Sequencing Hub サービス一覧
BaseSpace Sequencing Hub サービス一覧 ベーシックはお試し版となります お勧めはプロフェッショナルの従量価格制となります。 7
Slide 8: データ解析計算量例 iCreditで計算できるおよそのサンプル数
データ解析計算量例 250 iCreditで計算できるおよそのサンプル数 シーケンスデータの量などにより費用は前後しますので、こちらは目安とお考え下さい。 1 iCredit；約20分の解析が可能（おおよその目安） 1 iCredit=120円となります (2018年3月現在) 8
Slide 9: BaseSpace Sequencing Hubのライセンス契約
BaseSpace Sequencing Hubのライセンス契約に は利用申込書が必要です。 こちらはイルミナもしくは担当代理店にお問い 合わせください 無料のベーシック版の場合は、アカウ ント取得後１ヶ月間のお試しプランと なるので、利用申込書は必要ありませ ん。 9
Slide 10: RNA-Seqの情報解析
RNA-Seq Ot #2824 GATACTGGGAA TTGGAATTAG) : illumina’
Slide 11: 情報解析を実際にやってみよう
情報解析を実際にやってみよう 1. 解析を行うための”Project”を作成します。 2. 作成したProjectにFASTQをアップロードします。 3. RNA-Seq Alignment AppでAlignmentを実行し、「①遺伝 子発現量(FPKM)の算出」、「②融合遺伝子の検出」、「③ バリアント・変異(cSNP)の検出」、「④ Novel Transcript Assembly」を行います。 4. さらに、Cufflinks Assembly & DEを実行し、「二郡間解 析」を行います。 今回は、Universal Human Reference (UHR)とBrainのmRNA
Slide 12: BaseSpaceアカウントを取得しよう
BaseSpaceアカウントを取得しよう “BaseSpace”と検索すればHPにたどり着けます https://basespace.illumina.com/home/index 登録には、お名前とメールアドレスが必要です、イルミナシーケンサーをお持ちでな い方もお使いいただけます。 アカウント取得後、1か月間はお試し期間(ベーシックプラン)として、解析を無償で行 うことが可能です。 12
Slide 13: 解析を実施するProjectの作成
解析を実施するProject（作業を行う場所）の作成 を行う MY DATA > Projects を選択します。 File > New > Project を選択し、Projectを作成します。 13
Slide 14: FASTQをProjectにアップロードする
FASTQ(塩基配列)をProjectにアップロードする 作成したProjectに入り、 File > Upload > FASTQ, VCF, Manifest files を選択します。 14
Slide 15: FASTQをProjectにアップロードする
FASTQ(塩基配列)をProjectにアップロードする FASTQファイルのドラッグ・アンド・ドロップでアップロード可能です。 注意！ アップロードするFASTQは、イルミ ナのFASTAQ形式であること。ファイ ル名やヘッダーがデフォルトのもので あれば問題ない。詳細はIllumina FASTQ Guidanceを参照ください。 大量のデータをアップロードしますの で、回線が遅い場合には、アップロー ドに時間がかかる、もしくはアップ ロードできない場合があります。 15
Slide 16: FASTQをProjectにアップロードする
FASTQ(塩基配列)をProjectにアップロードする サンプル名を入力します、ここで は”Brain-1”と入力しました。 ＊イルミナではサンプル を”BioSample”と呼びます。 ライブラリー名を入力します、ここで は”Brain_S7”と入力しました。 ライブラリー調製に用いたキットを選 択します。3rd Partyのキットを用いた 場合には、類似した適当なキットを選 択ください。こちらの項目は解析その ものには影響はありません。 16
Slide 17: その他関連ツール (SRA Import, FASTQ Tool Kit)
その他関連ツール (SRA Import, FASTQ Tool Kit) 17
Slide 18: SRAのデータを使用することが可能です
SRA (Sequence Read Archive) のデータを使用する ことが可能です https://www.ncbi.nl m.nih.gov/sra SRAは次世代シーケンサーのデータアーカイブとなります。SRX123456といった数字 を論文で見かけたことがあると思いますが、これらはSRA上での管理番号となります。 1 作成したProjectから Launch AppよりSRA Importを選択します。 18 2
Slide 19: SRA Import Appの実行
SRA Import Appの実行 SRA Import Appを用いれば、自分の 気になる遺伝子・トランスクリプト の挙動が、論文のRNA-Seqでどう なっているかを自分で調べることも 可能です。 SRAの番号を入力します SRA＊＊＊＊＊＊ SRAから読み込んだ FASTQを保存す る、”Project”を選択する。 三角フラスコのマークがあるAppは、 BaseSpace Lab Appです、独自の裁 量で提供しているサポート外のツー ルとなりますので、実行時には Disclaimer (免責事項)をご確認くだ Disclaimer (免責事項)を さい。 確認し、実行する。 19
Slide 20: FASTQ Toolkitの紹介
FASTQ Toolkitの紹介 ● FASTQに対してさまざまな加工を施すことが可能です - Sub-sampling / Base Trimming: リード数/リード長をそろえる。 - Adapter, Quality or Poly-A/T Trimming: アダプター・品質・PolyAでのトリミング。 - Read Filtering: リードの長さ・品質・GC量を基準としたリードの除去。 FASTQ Toolkitの実行の結果、リー ドがどのように変化したかは表と図 で確認することが可能です。 20
Slide 21: RNA-Seqの解析の流れ
RNA-Seqの解析の流れ RNA-Seq Alignment 融合遺伝子 Alignment 検出 Variant Call 発現定量 (STAR (Manta or (Isaac) (Cufflinks) or TopHat) TopHat-fusion) 出力結果: アライメント・遺伝子発現・融合遺伝子・バリアントコール・トランス クリプトアセンブリー Cufflinks Assembly & DE Transcript Merge Differential Assembly Assemblies Expression (Cufflinks) (Cuffmerge) (Cuffdiff
Slide 22: RNA-Seq Alignment App
RNA-Seq Alignment App 解析ワークフロー ● TopHatもしくはSTARを用いた Alignmentの実施 ● 融合遺伝子の検出 - STARを用いた場合にはMantaを使用 - TopHatの場合にはTopHat Fusionを使用 - Paired-End Sequenceのデータが必要 ● SNP・Short INDELのバリアント検 出 - Isaacを用いたVariant Call ● 遺伝子の発現量 (FPKM）の算出 - Cufflinksのモジュールを用いてFPKMの算出 を行います。 - 遺伝子発現量は、遺伝子・トランスクリプト ごとに算出されます。 2
Slide 23: RNA-Seq Alignment App Alignerについて
RNA-Seq Alignment App Alignerについて ● ”TopHat”と”STAR”の二つを選択することが可能です。 STARのアルゴリズム Dobin, et al., (2013) Alignerの議論はNGS掲示板をご参照ください TopHatのワークフロー Trapnell et al., (2009) https://www.biostars.org/ http://www.rna-seqblog.com/ Trapnell, Cole, Lior Pachter, and Steven L. Salzberg. "TopHat: discovering splic
Slide 24: RNA-Seq Alignment App 実行に必要なもの
RNA-Seq Alignment App 実行に必要なもの ● サンプルあたり、10万～4億リードのシーケンスデータ。 ● 一回の解析において、すべてのサンプルのリード数の合計が40 億リードまで。 ● リードの長さが35~500塩基の間であること。アダプタートリム などで35塩基より短くならないように注意が必要。 ● 融合遺伝子の検出にはペアエンドのリードが必要。 ● 2018年3月現在で使用されているソフトウェアバージョンは以 下の通り、TopHat (Aligner): 2.1.0、STAR (Aligner): 2.5.0a、 Bowtie (Aligner): 0.12.9、Bow
Slide 25: RNA-Seq Alignment App 実行可能なライブラリー
RNA-Seq Alignment App 実行可能なライブラリー ● RNA-Seq Alignment Appは以下のライブラリー調製キットに対応し ています。 - TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit - TruSeq Stranded Total RNA Sample Prep Kit - TruSeq RNA Access (Exome) Library Prep Kit - TruSight RNA Pan-Cancer Panel - TruSight RNA Fusion Panel - ScriptSeqライブラリー調製キット全般 - 上記
Slide 26: RNA-Seq Alignment Appの実行
RNA-Seq Alignment Appの実行 1 2 作成したProjectから Launch Appより”RNA-Seq Alignment”を選択します。 26
Slide 27: RNA-Seq Alignment Appの設定
RNA-Seq Alignment Appの設定 # App Session Name 実施するSessionの名前を入力、デフォルトでもよい が、解析目的を名前にした方があとで見直す際に便利 例: RNA-Seq Alignment_180328_UHR_&_Brain #Save Result To RNA-Seq Alignmentの結果を保存する”Project”を選択 します。 # BioSample 解析を行う検体を選択します、今回の場合は先ほど アップロードしたFASTQを選択をする形になります。 27
Slide 28: Stranded（転写方向）の情報を入力する
BioSampleを選択後にStranded（転写方向）の 情報を入力する必要があります Read1の向きが転写方向と同じであればFirst Strandを選択、逆方向であればSecond Strandを選択 No: 転写方向がわからないライブラリー調製手法で実施した場合 First Strand: TruSeq Stranded mRNA/Total RNA Sample Prep Kitで調製した場合 Second Strand: ScriptSeq v2 RNA-Seq Library Preparation Kitで調製した場合 28
Slide 29: RNA-Seq Alignment Appの設定
RNA-Seq Alignment Appの設定 # Reference Genome 参照配列を選択します、対応生物は以下に示すとおりです。 Homo sapiens UCSC hg19 (RefSeq & Gencode gene annotations) Homo sapiens UCSC hg38 (RefSeq & Gencode gene annotations) Mus musculus UCSC mm10 (RefSeq gene annotation) Mus musculus UCSC mm9 (RefSeq gene annotation) Rattus norvegic
Slide 30: RNA-Seq Alignment Appの設定
RNA-Seq Alignment Appの設定 # QC Mode, QC Reads (Reads Pairs) 解析するリード数を限定したライブラリーの品質の確認のための解析を実施 する場合に使用する。チェックを入れるとQC Readsで指定したリード数で の解析を実施する。(Coverage Uniformityやライブラリーサイズの検討で使用 など) # Novel Transcript Assembly Cufflinksを用いたRNAの転写産物のアセンブリーを実施する場合にチェック する。CufflinksのAssemblyには参照配列が必要なので、参照配列がない生 物には対応し
Slide 31: RNA-Seq Alignment Appの設定
RNA-Seq Alignment Appの設定 # Call Fusion 融合遺伝子の検出を行うかどうかのチェックを入れます。融合遺伝子の検出 に使用されるソフトウェアは、Alignerの選択に依存します。 # ERCC Spike-in Controls ライブラリー調製を行う際に、ERCC RNA Spike-In Mix (ThermoFisher)を 使用した場合にはチェックを行う。ERCCを基準に遺伝子発現量(FPKM)の 補正は行わないが、ERCCの発現量が算出される。 # Trim TruSeq Adapters TruSeqライブラリー調製キットを使用している場合には、チェ
Slide 32: 解析が始まるとステータスが表示されます
解析が始まるとステータスが表示されます。 Durationが時差を考慮せずに、 +9時間で表示されてしまいま す 解析が始まると、ステータスが表示されます、この画面は閉じて も解析は止まりません。解析が終了すると、BaseSpaceに登録し たメールアドレスに連絡が入ります。 32
Slide 33: RNA-Seq Alignment Appの解析が終了しました
RNA-Seq Alignment Appの解析が終了しました。 今回は、4検体それぞれおよそ4000万ペアリードを解析したところ、7時間35分 で解析が終了し、解析コストは84 iCredits* (10,080円) となりました。 *1 iCredit = 120円 (2018年3月現在)で換算しています。 33
Slide 34: RNA-Seq Alignmentの解析結果
RNA-Seq Alignmentの解析結果 問題がないかの確認を行う 解析結果のサマリーが表や図で表示されます、解析結果に問題がないかの確認を行います。 %Total Aligned % Abundant % Stranded :参照配列ゲノムにアライメ : ミトコンドリアやrRNAといった 転写方向と同じ方向でアライメン ントされたリードの割合 Abundantなものにアライメント トされたリードの割合 ↓ された割合 ↓ シーケンス品質は問題ない ↓ App実行時の設定を正しく行った か？他の生物のコンタミネー mRNA単離やrRNAの除去のス か？ ションの可能性はないか？ テップで問
Slide 35: RNA-Seq Alignmentの解析結果
RNA-Seq Alignmentの解析結果 問題がないかの確認を行う Insert Length Distribution ペアエンドシーケンス実施時の場合に、 アライメントされたRead 1とRead 2の 間の距離からライブラリーのサイズ分 布を示します。 Alignment Distribution Coding、UTR、Intron、Intergenicにア ライメントされたリードの割合を示し ます。 35
Slide 36: Alignment Distributionは用いるキットにより変わる
Alignment Distributionは用いるキットにより、 各領域のアライメント分布が変わる TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit mRNAを単離するので、IntronとIntergenicの 割合は少ない。 TruSeq Stranded total RNA Sample Prep Kit 成熟前のmRNAやnon-coding RNAを含むので、 intronとintergenicの割合が多い。 TruSeq RNA Exome (Access) 全RNAライブラリーからCoding Regionを濃縮 するので、Codingの割合が多い。 36
Slide 37: RNA-Seq Alignmentの解析結果
RNA-Seq Alignmentの解析結果 問題がないかの確認を行う Transcript Coverage 転写産物の5’末端から3’末端へのリー ドのカバレッジの分布が示されてい る。 5’末端 3’末端 TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit TruSeq Stranded total Oligo dTビーズでmRNA RNA Sample Prep Kit を単離するので、3’末端 逆転写酵素はRNAの 側のカバレッジが上がる 3’>5’方向へ進むので、5’ 傾向がある。 末端側がカバレッジが上 ↓ がる傾向にある。 極端に3’末端のカバレッ ジが上
Slide 38: 解析結果のダウンロード (1)
解析結果のダウンロード (1) 1 アプリケーション実行結果の右上のFile > Download > Analysisと進むと解析結果を一括して ダウンロードすることが可能です。 2 ダウンロード容量は非常に大 きいので、専用のダウンロー ダーを用いてのダウンロード を行います。 38
Slide 39: 解析結果のダウンロード (2)
解析結果のダウンロード (2) 左上の”FILES”をクリックすると、出力さ れたファイル一覧をブラウザ上で確認し、 ダウンロードすることが可能です。 必要なファイルをクリックでローカ ルにダウンロード可能です。 39
Slide 40: RNA-Seq Alignment App 主要な出力ファイル
RNA-Seq Alignment App 主要な出力ファイル ● 遺伝子発現解析結果ファイル (.fpkm_tracking) - Reference (RefSeqなどのデータベース)とAssemblyの二つを基準にしたもので算出さ れています。 - Genes, isoformの２種類が出力されます。 ● アライメントの結果ファイル (BAMファイル) - 各リードのアライメント結果、IGVなどのゲノムブラウザで表示が可能。 ● Novel Transcript Assemblyの結果ファイル (GTFファイル) - Assemblyして得られた転写産物(遺伝子)がゲノム上のどこにあるか
Slide 41: 遺伝子発現の結果
遺伝子発現の結果 ¥cufflinks¥referenceの下のFPKM_trackingの例 発現量 遺伝子 (FPKM) *.genes.fpkm_tracking :遺伝子ごとの発現量がまと められている 発現量 トランスクリプト (FPKM) *.isoforms.fpkm_tracking トランスクリプトモデル(ex. NM_000014)ごとの発現量 がまとめられている 41
Slide 42: 遺伝子発現の結果
遺伝子発現の結果 ¥cufflinks¥assemblyの下のFPKM_trackingの例 発現量 遺伝子 (FPKM) *.genes.fpkm_tracking Assemblyで構築した遺伝子モデル に従い、遺伝子(CUFF1, CUFF2………)ごとに発現量がま とめられている。 発現量 トランスクリプト (FPKM) *.isoforms.fpkm_tracking Assemblyで構築した遺伝子モデ ルに従い、トランスクリプト (CUFF1.1, 1.2, 1.3)ごとに発現 量がまとめられている。 42
Slide 43: FPKMについて
FPKM (Fragments Per Kilo base per Million mapped reads) について サンプルによって読み量はバラつきがあるので、100万リード読んだということで正規化 Sample A Sample B Sample C 2,000万リード 4,000万リード 8,000万リード すべての遺伝子は1 KbのExonから成り立つということで正規化 Exonの総長が長い Exonの総長が短い =リードもたくさん貼りつく =リードは少ししか貼りつかない Mortazavi, Ali, et al. "Mapping and quantifying mammali
Slide 44: アライメント結果(BAMファイル)はIGVで確認できます
アライメント結果(BAMファイル)はIGVを用いて、 確認を行うことが可能です。 BaseSpace上に保存したBAMファ ローカルに保存したBAMファイルなどの閲覧 イルなどの閲覧 Broad InsitituteのIGVのHPよりダウンロードください http://software.broadinstitute.org/software/igv/ IGVはJava環境で動作しますので、特別なPCの準備は必要なし。 使い方については、本家BroadのHPがわかりやすいです。 http://software.broadinstitute.org/software/igv/UserGuide 4
Slide 45: IGVによるデータの可視化
IGVによるデータの可視化 BamファイルによるAlignmentの状況 Junctions.bedによるSplicing Junctionの可視化 Sashimi Plotを用いたSplicing Junctionの可視化 融合遺伝子の確認 45
Slide 46: GTFファイルについて
GTFファイルについて ● GTF (Gene Transfer Format ) - 遺伝子構造を示すファイル、ゲノム上のどの位置に遺伝子のそれぞれのエクソンがあ るかを示している。 - Novel Transcript Assembly実行時に、新規転写産物（遺伝子）を示すファイルとして出 力される。 - GTFファイルの説明: https://asia.ensembl.org/info/website/upload/gff.html UCSC Genome BrowserやIGVなどに読み込んで、遺伝子構造を確認することもできます。 46
Slide 47: 融合遺伝子解析結果
融合遺伝子解析結果 (RNA Alignment App出力) 融合遺伝子検出解析結果 (STAR-Mantaを使用した場合) *パネル製品(TruSight RNA Pan Cancer)を選んだ場合には、 標的遺伝子が黄色でシェーディングされます。 融合遺伝子の融合部 位をサポートする Gene A Gene B リード数とスコアが 表示されます。 Split Read Paired Read 47
Slide 48: 変異解析結果(VCFファイル)はVariantStudioで表示可能
変異解析結果(VCFファイル)はVariantStudioで表示や アノテーション・フィルタリングが可能 COSMIC Databaseに登録のある変異への絞り込み タンパク質の機能への影響 集団内頻度での絞り込み フィルタリング 48
Slide 49: Cufflinks Assembly & DEの実行
Cufflinks Assembly & DEの実行 1 作成したProjectから Launch AppよりCufflinks Assembly & DEを選択します。 2 49
Slide 50: Cufflinks Assembly & DEの設定
Cufflinks Assembly & DEの設定 # App Session Name 実施するSessionの名前を入力、デフォルトでもよいが、 解析目的を名前にした方が見直す際に便利 例: Cufflinks_180328_UHR_&_Brain #Save Result To Cufflinks Assembly & DE Appの結果を保存する”Project” を選択します。(こちらはすでに選択されているはず) 50
Slide 51: Cufflinks Assembly & DEの設定
Cufflinks Assembly & DEの設定 先ほど実行した、RNA-Seq Alignment Appの 設定と同じものを入力してください。 入力を間違えると、次のサンプル選択の際 に、解析したいサンプルを選ぶことができ ません。 51
Slide 52: Cufflinks Assembly & DEの設定
Cufflinks Assembly & DEの設定 二群間解析を実施するグループの登録を行います。 LABELにGroup名を入力してください、 今回は”UHR”と”Brain”と入力します。 ２ POLYAの部分には、 PolyA精製を行った場合 ４ にはYesを選択してくだ さい。使用したキット に依存します。 DATASETSの部分に、RNA-Seq ３ Alignment Appの実行結果(サンプル) を選択します。 “Add a New Row”をクリックすると、登録 52 １ できるGroup数を追加することができる。
Slide 53: Enable Pairwise Differential Expression Analysis
Enable Pairwise Differential Expression Analysis 二群間解析を行う場合にはチェックを入れる Select Pairs of Groups for Differential Expression Analysis チェックを入れた場合には、比較を行う二群間 の登録を行います、 53
Slide 54: Cufflinks Assembly & DE 解析終了画面
Cufflinks Assembly & DE 解析終了画面 今回は、4検体 (検体あたり4000万ペアリード)のRNA-Seq Alignment Appの結果 を用いて、二群間解析を行い、コストは1440円*となりました。 *1 iCredit = 120円 (2018年3月現在)で換算しています。 54
Slide 55: Cufflinks Assembly & DEの解析結果
Cufflinks Assembly & DEの解析結果 カウントされた遺伝子・トランスリプト 新規転写産物の数について 発現量の違いがみられた遺伝子・トラ ンスクリプトの数 発現差のある遺伝子 特定遺伝子の表示 サンプル間の発現量の相同性 スキャッタープロット Gene Browser Differential Expression Heatmap 55
Slide 56: Cufflinks Assembly & DEの主な出力ファイル
Cufflinks Assembly & DEの主な出力ファイル ● *.merged.gtf: 群間解析を実施した場合に、両方の群で得られたGTF を合わせたもの。 ● FPKM_trackingファイル - *.gene.fpkm_tracking:遺伝子ごとの発現量 - *.isoform.fpkm_tracking:トランスクリプトごとの発現量 - これらに加えて、cdsとtss_groupも出力されます。 - FPKM_trackingは、Reference (RefSeqといった指定したデータベース)と GTF (新しく予測した遺伝子モデル)の二つを基準に算出されます。 ● DIF
Slide 57: DIFFファイルについて
DIFFファイルについて 遺伝子名 比較する二群間のサンプル q value (FDR) の発現量とFold Exchange たとえば、q value 0.05以下で、log2 Fold Exchangeが3以上の遺伝子に絞り込み、 有意に発現差が大きい遺伝子を絞り込みます。 57
Slide 58: Brainで発現が高い遺伝子をピックアップしてパスウェイ解析
実際にBrainで発現が高い遺伝子をピックアップ してパスウェイ解析をやってみる BrainとUHRとの発現比較で、log2 fold exchangeで3以上で、q valueが0.05以下の遺 伝子をBrainで有意に発現量が高い遺伝子とい うことで選抜します。 DIFFファイルをExcelで開いて、フィルタリン グして、1819遺伝子をピックアップ。 この1819遺伝子の”Gene Symbol”のリストを 使って、パスウェイ解析を行います。 58
Slide 59: パスウェイ解析ツール
パスウェイ解析ツール イルミナではパスウェイ解析ツールを提供していませんが、 無償のウェブツールとしては以下のようなものがあります。 DAVID ToppGene https://david.ncifcrf.gov/ https://toppgene.cchmc.org/ DAVIDはよく使われており、Web上で使い方をまとめた動画やHPも多くあります 59
Slide 60: DAVIDを使うといろいろできます。
DAVIDを使うといろいろできます。 KEGG Pathwayに該当遺伝子を表示 遺伝子が関与する疾患を表示 (OMIMデータベース) 60
Slide 61: ToppGeneを使うと、関わるGOが表示されます
ToppGeneを使うと、関わるGOが表示されます Brainに特異的なものが表示さ れました 61
Slide 62: DE-Seq2を用いた二群間解析も行えます。
DE-Seq2を用いた二群間解析も行えます。 DESeq2は、BaseSpace Lab Appとなり、サポート外の ツールとなります。実行の際には、 Disclaimer (免責事項) が出ますので、ご了承のうえ実行ください。 ● Cufflinks Assembly & DEと同じように、事前にRNA-Seq Alignment Appの実行が必要になります。 ● 二群間解析を行うことが可能です。 ● DESeq2ですが、正規化の方法がFPKMではなく、独自のGene Countで行われます。 62
Slide 63: RNA Expressがお勧めです
もっと手軽にコストを抑えて発現解析（のみ） をしたい方にはRNA Expressがお勧めです。 STARとDESeq2を用いて、遺伝子発現 解析・二群間解析を行います。 4検体 (検体あたり4,000万ペアリード)で、二群間解析を行ったところ、解析は3 時間10分で終了し、コストは1,200円でした。 RNA-Seq Alignment + Cufflinks Assembly & DEでは、コストは11,250円でした。 出力結果は、アライメント結果 (BAMファイル)、遺伝子の発現解析(Gene Count)と二群 間解析の結果となります。Novel Transcript Assembly
Slide 64: まとめ
まとめ ● BaseSpaceを使えば、だれでも簡単にRNA-Seqの情報解析を 始めることが可能です。アカウント取得後、一ヶ月間は無償 でBaseSpaceをお使いいただけます。 ● RNA-Seq Alignment Appで発現解析、融合遺伝子検出、SNP 検出、Novel Transcript Assembly (参照配列が必要)を行うこ とが可能です。 ● さらに、Cufflinks Assembly & DEやDESeq2のAppを用いる ことで二群間解析を行うことが可能です。 ● RNA Express Appを用いれば、手軽にコストを抑えた遺伝子 発現解析・二群間解析を行えます
Slide 65: 今回使用したデモデータ
今回使用したデモデータ 今回はイルミナで公開している、NextSeqで取得したBrainとUHRのRNA- Seqのシーケンスデータを用いました # Demo RunのLink https://basespace.illumina.com/s/6Hags6oROgwI # Demo ProjectのLink https://basespace.illumina.com/s/Nga9A4l66COX 65
Slide 66: Appendix
Appendix • RNA-Seq Alignment Online Help • https://support.illumina.com/help/BS_App_RNASeq_Alignment_OLH_1000000 006112/Content/Source/HomePages/Home_Page_RNASeq_Alignment_App.ht m • Cufflinks Assembly & DE Online Help • https://support.illumina.com/help/BS_App_CufflinksAssembly_OLH_10000000 06109/C
Slide 67: 関連ウェビナー
関連ウェビナー ● RNA-Seqをはじめよう : 実験デザイン編 -これからRNA-Seqを始める方に- - https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-180131-j.html ● RNA-Seqをはじめよう ライブラリー調製編：絶対に失敗しないライブラ リー調製 - https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-180228-j.html ● BaseSpace Sequence Hubを使用したデータ解析の基本【イルミナ iSchool 初級 - https://jp