Slide 1: これからRNA-Seqを始める方に
イルミナウェビナー 「RNA-Seqをはじめよう」シリーズ 実験デザイン編 これからRNA-Seqを始める方に 寺倉 伸治 シニアフィールドアプリケーションサイエンティスト Jan/31/2018 © 2016 Illumina, Inc. All rights reserved.
Slide 2: 「RNA-Seqをはじめよう」シリーズのご案内
イルミナウェビナー 「RNA-Seqをはじめよう」シリーズのご案内 絶対に失敗しない クラウドを用いた これからRNA-Seqを始める方 ライブラリー調製 簡単クリック情報解析 実験デザイン編 ライブラリー調製編 情報解析編 1月31日 2月28日 3月末予定 • これからRNA- • ワークフローは Seqを始める方に、 もちろん、実験 • 解析アプリの実 実験デザインをど を行う上での落 行方法、出力結 のように立てたら とし穴、ライブラ 果の紹介行い よいかの案内を リーの評価方 ます。 行います。 法を紹介します。 6
Slide 3: 今回のウェビナーの流れ
今回のウェビナーの流れ ● RNA-Seq概要 - RNA-Seqで何ができるか？わかるか？ ● ワークフローと実験デザイン - どれぐらい読めばよいのか？ - ライブラリー調製キットは？ - コストは？ ● 情報解析についての紹介 - BaseSpaceの紹介 ● まとめ 7
Slide 4: RNA-Seqの概要
RNA-Seq OH SFGACCCTIAACCTT AATTCTIGCCTCTICATAGGTA ATACTGGGAATTGGHATTAG GAcccTiAAccTTa 7 ATGGAGT gGaTese illumina’
Slide 5: 研究トレンドは、マイクロアレイからRNA-Seqへ
研究トレンドは、マイクロアレイからRNA-Seqへ 9
Slide 6: プローブベース検出のRNA発現解析の限界
プローブベース検出のRNA発現解析の限界 プローブは1つのアイソフォームのみの検出 ATG AAAAAAA ATG AAAAAAA ATG AAAAAAA ATG AAAAAAA ATG AAAAAAA pA pA TSS1 TSS2 TSS3 PAS1 PAS2 Probe-based detection RNA-seq 10
Slide 7: シーケンサーでのRNAの発現検出
シーケンサーでのRNAの発現検出 カバレッジを計算して、異なるアイソフォームの発現を検出します ATG AAAAAAA ATG AAAAAAA ATG AAAAAAA ATG AAAAAAA ATG AAAAAAA TSS1 TSS2 TSS3 RNA-seq Coverage 11
Slide 8: RNA-Seq解析の概要
RNA-Seq解析の概要 リファレンスゲノムがあるヒト、モデル生物等 Oligo(dT)を利用してmRNAを単離 RNAを逆転写してcDNAを作製 アダプタ付きライブラリー作製 シーケンシング リファレンスゲノムへのアライメント トランスクリプト毎の発現解析が可能 ・Alternative Splicing同定 ・新たな転写産物の予測 ・SNP解析等 Wang Z, Gerstein M, Snyder M. (2009). "RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics". Nature Reviews Genetics 10 (1):
Slide 9: RNA-Seq解析の概要(リファレンスゲノムなし)
RNA-Seq解析の概要 Oligo(dT)を利用してmRNAを単離 リファレンスゲノムの無い生物種 RNAを逆転写してcDNAを作製 アダプタ付きライブラリー作製 シーケンシング De novoでアセンブルして 転写産物データベースを 構築してから遺伝子発現解析 転写産物のモデルを構築 転写産物モデルへアライメント 遺伝子発現解析 ・Alternative Splicing同定 ・新たな転写産物の予測など Nat Rev Genet. 2011 Sep 7;12(10):671-82. doi: 10.1038/nrg3068. Next-generation transcriptome a
Slide 10: トランスクリプトームアセンブル : Trinity
トランスクリプトームアセンブル : Trinity 画期的なアセンブルツール ● 開発したソフト Trinity が哺乳類に対しても微生物に対しても 非常に良い転写産物のアセンブル結果を提供 ● 分裂酵母でのテスト結果 - ７６塩基ペアエンド解析 - 50 M ペア、100 M リード - インサートサイズは 225 bp から 425 bp - 結果: 4338 / 5064 、転写産物の約８６％の全長をカバー ● マウスでのテスト結果 - ７６塩基ペアエンド解析 - 52.6 M ペア、105.2 M リード - 結果 10724 遺伝子をカバー（マウス遺伝子の 52%) - 350塩基以
Slide 11: RNA-Seq で可能なこと
RNA-Seq で可能なこと スプライスバリアントごとの発現解析 融合遺伝子の検出 新規と既知の転写産物の同定 ノンコーディングとアンチセンスRNAの把握 July 2008 - Vol 5 No 7 Nature Methods 5 (2008) 超微量インプットからの発現解析 The beginning of the end for microarrays? 15
Slide 12: RNA-Seq Application
RNA-Seq Application RNA-seq for detection of alternative スプライスバリアントごとの発現プロファイル splicing events ✓ 各遺伝子の転写産物アイソフォームごと の存在量（1 つの遺伝子の複数の存在 量） を解析し、遺伝子発現を定量化した い。 ● リードをリファレンスにマップし、転写産物 の選択的スプライシングを検出 ● PEはスプライスを考慮するのに重要 PMID: 21191423 16
Slide 13: RNA-Seq Application
RNA-Seq Application ペアリードのアライメント位置が 融合遺伝子の発現解析 大きく離れている ペアのリード ● がん分子標的治療標的として着目 ● 定性的および定量的RNA分析が可能 BCR (Chr 22) ABL (Chr 9) ● 融合遺伝子に関する事前の情報不要 mRNA ● PEは融合遺伝子を検出するのに重要 スプリットリード ● 専用のソフトウェアによる処理が必要 融合部位のシーケンスリード Nature. 2007 Aug 2;448(7153):561-6. Epub 2007 Jul 11. 17 PMID:17625570
Slide 14: RNA-Seq Application
RNA-Seq Application 新規と既知の転写産物の同定 ● 転写産物の検索と数の推定 ● トランスクリプトームをベースとしたアノテーションの改善が可能 Cufflinksを紹介した論文 PMID: 19289445 PMID: 20436464 exonを考慮してMapするTopHat nature biotechnology VOLUME 28 NUMBER 5 MAY 2010 18
Slide 15: RNA-Seq Application
RNA-Seq Application ノンコーディング とアンチセンスRNAの把握 PMID:19188922 遺伝子の制御は複雑で、階層的である アンチセンスとロングノンコーディング（lncRNA) の発現解析により、トランスクリプトーム全体の 遺伝子の制御の詳細を理解できる PMID: 23828888 PMID: 22110045 RNA Antisense Purification (RAP): A Method to Map lncRNA Interactions with Chromatin 胚発生過程における1133のlncRNAsを同定 組織特異的な発現があることを示す 19
Slide 16: RNA-Seq Application
RNA-Seq Application 超微量インプット とシングルセル 微量な、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションやFACS後などの 1–1000 の細胞数、もしくは10pg～10ngの高品質な total RNAからのシーケンスが確立している :PMID: 24419370 http://www.illumina.com/techniques/sequencing/rna-sequencing/ultra-low- input-single-cell-rna-seq.html http://jp.illumina.com/content/dam/illumina- Smart-Se
Slide 17: Single Cell Transcriptome解析
Single Cell Transcriptome解析 ddSEQ™ Single-Cell Isolator Bio-Rad SureCell™ WTA 3’ Library Prep Kit illumina SureCell の製品HP https://jp.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/surecell-wta-ddseq.html 21
Slide 18: イルミナ RNA-Seq
4 JL=F RNA-Seq I—77n— lumina’
Slide 19: トランスクリプトーム解析ワークフロー
トランスクリプトーム解析ワークフロー BaseSpace/ TopHat BaseSpace Onsite Cufflinks 実験デザイン ライブラリー調製 シーケンス 1次解析 2次解析 3rd パーティー サンプルから答えまで、一連の工程をサポート 23
Slide 20: 実験デザインとRNA-Seqワークフロー
実験デザインとRNA-Seqワークフロー - サンプルからシーケンスまで サンプルについての情報は？ Biological 分解度は? sample total RNAの量は? AAAAA AAAAA どんなRNAに興味があるか? RNA pool mRNA? miRNA? non-conding RNA? AAAAA Convert to cDNA 転写方向の情報は必要か？ Complete 解析はカウンティンングのみ？ libraries and QC トランスクリプトバリアント毎の詳細を見る? 融合遺伝子の検出は？ リード数はどのくらい必要？? Sequencing シングルリード? ペ
Slide 21: RNA-Seq の目的と実験デザイン (ヒト・マウスの例)
RNA-Seq の目的と実験デザイン (ヒト・マウスの例) サンプルあたりのコスト: 新規転写産物の 遺伝子発現 トランスクリプトーム解析 探索 FFPEで、 新規探索 解析 50-75bp x2 75bp〜125bp x2 75bp〜 50-75 bp x 1 バリアントごとの解析、 アノテーション、 125bp x2 融合遺伝子(PE必要)、 詳細なトランスリプトーム 遺伝子発現差 細胞あたり1コピー以下の遺伝子、 解析、 新規発見、 解析、 新規トランスクリプトーム ncRNA、 発見、 1000万 2500万 5000万 1億 2億…. (リード数) 単純な遺伝子発現解析のみであれば、
Slide 22: サンプル数、リード数、リード長の参考となる大規模解析
サンプル数、リード数、リード長 の参考となる 大規模解析 Biological Technical プロジェクト クラスター数 リード長 replicates replicates 発現変動が非常 同組織/細胞での に大きい場合、 ENCODE 追加解析を2回 3000万 2x 30 bp以上 同RNAサンプル 以上 で追加解析 MAQCIII 4～5回 - 1億1000万 2 x 100 bp ABRF 3回 - 3760万 2 x 50 bp 「Biological replicate」は、実験サンプルとなる生物の個体間差などに起因する実験誤差を小さくするために行な う反復実験。同じ集団か
Slide 23: さまざまな生物における遺伝子発現プロファイリング
さまざまな生物における遺伝子発現プロファイリング 最少の必要データ量・カバレッジ トランスクリプトームサイズ 発現解析に推奨する 生物種 (推定値) 最少データ量 微生物 (酵母など) 0.8 – 3.0 Mb 12 - 45 万リード モデル生物 (線虫、キイロショウジョウバエ、 10 – 30 Mb 150- 450 万リード シロイヌナズナなど) 脊椎動物、高等植物、など 30 – 200 Mb 500 – 1500 万リード • These are general guidelines and good starting points for experimental design.
Slide 24: イルミナシーケンサーのラインナップ
イルミナシーケンサーのラインナップ システム MiniSeq MiSeq NextSeq 500 HiSeq 2500 HiSeq 4000 ランモード 中出力 高出力 V2 V3 中出力 高出力 Rapid 高出力 - 最大スループット (Gb) 2.4 7.5 7.5 15 39 120 150 500 750 最大クラスター数 800万 2,500 万 1,500万 2,500万 1.3億 4億 3億 20 億 25 億 ラン時間 4-24時間 4-55時間 12-29時間 7-60時間 1-6日 1-3.5日 最大リード長 2 x 150 2 x 150 2 x 150 2 x 300
Slide 25: mRNA-Seq
mRNA-Seq 遺伝子発現解析（シングルリード・1,000万リード） MiniSeq MiSeq High Output V2 V3 Cat#: FC-420-1001 MS-102-2001 MS-102-3001 使用する試薬 MiniSeq High Output Kit MiSeq Reagent Kit v2 MiSeq Reagent Kit v3 製品名 (75 Cycles) (50 Cycles) (150 Cycles) シーケンス条件 1X 76 1X 51 1X 76 試薬コスト 149,000円 148,000円 162,000円 1 Flowcell あたりのクラ
Slide 26: mRNA-Seq
mRNA-Seq 遺伝子発現解析（シングルリード・1,000万リード） NextSeq 500/550 HiSeq 1500/2500 High Output Mid Output High Output Rapid Run (V4試薬) GD-402-4002 GD-401-4001 Cat#: FC-404-2001 FC-404-2005 FC-402-4022 FC-401-4002 使用する NextSeq NextSeq HiSeq SR Rapid HiSeq SR Cluster Kit 試薬 500/550 Mid 500/550 High Cluster Kit v2 v4
Slide 27: mRNA-Seq：トランスクリプトーム解析
mRNA-Seq：トランスクリプトーム解析 （ペアエンドリード・2,500万クラスター） NextSeq 500/550 HiSeq 1500/2500 High Output Mid Output High Output Rapid Run (V4試薬) PE-402-4002 PE-401-4001 Cat#: FC-404-2001 FC-404-2002 FC-402-4022 FC-401-4002 使用する NextSeq NextSeq HiSeq PE Rapid HiSeq PE Cluster Kit 試薬 500/550 Mid 500/550 High Cluster
Slide 28: mRNA-Seq：より詳細なトランスクリプトーム解析
mRNA-Seq：より詳細なトランスクリプトーム解析 （ペアエンドリード・5,000万クラスター） NextSeq 500/550 HiSeq 1500/2500 High Output Mid Output High Output Rapid Run (V4試薬) PE-402-4002 PE-401-4001 Cat#: FC-404-2001 FC-404-2002 FC-402-4022 FC-401-4002 使用する NextSeq NextSeq HiSeq PE Rapid HiSeq PE Cluster Kit 試薬 500/550 Mid 500/550 High Clu
Slide 29: mRNA-Seq：新規転写産物の探索・さらに詳細な解析
mRNA-Seq：新規転写産物の探索・さらに詳細な解析 （ペアエンドリード・1億クラスター） NextSeq 500/550 HiSeq 1500/2500 High Output Mid Output High Output Rapid Run (V4試薬) PE-402-4002 PE-401-4001 Cat#: FC-404-2003 FC-404-2004 FC-402-4021 FC-401-4003 FC-402-4022 使用す HiSeq PE Rapid Cluster Kit v2 HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot る試薬 NextSeq Next
Slide 30: イルミナの推奨実験デザイン : コスト試算
イルミナの推奨実験デザイン : コスト試算 サンプルあたりのコスト (ライブラリ調製キット＋ラン試薬) 最初は、読み量に余裕を持ったデザインをとりましょう MiniSeq MiSeq NextSeq HiSeq 推奨クラス 推奨リード 目的 HO V2 V3 Mid High Rapid Run HO ター数 長 2500万 1500万 2500万 1.3億 4億 3億 20億 ≦2 ≦1 ≦5 ≦26 ≦40 ≦30 ≦200 1x50 or 発現プロファイル 1000万 1x75 ¥84,625 ¥158,125 ¥42,525 ¥17,472 ¥16,650 ¥18,995 ¥15,90
Slide 31: ライブラリー調製キット
AIST 5499) Ayk illumina’
Slide 32: ライブラリー調製/アレイ キットセレクター
ライブラリー調製/アレイ キットセレクター http://www.illumina.com/library-prep-array-kit-selector.html 36
Slide 33: キットセレクター 比較表の表示
ライブラリー調製/アレイ キットセレクター 比較表の表示 37
Slide 34: イルミナのRNA-Seq用ライブラリー調製キットの紹介
イルミナのRNA-Seq用ライブラリー調製キットの紹介 TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit mRNAの解析 RNA-Seqのスタンダード！ TruSeq RNA Access/ TruSight Pan- ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織由来の Cancer Library Prep Kit 分解したRNAでも解析可能(対象生物はヒト)。 TruSeq Stranded Total RNA rRNA(細胞質)を除去し、mRNAとpolyAを Ribo-Zero H/M/R 持たないRNAを解析。 Goldではミトコンドリ ア由来のrRNAも除去
Slide 35: TruSeq Stranded mRNA, Total RNA サンプル調製キット特徴
TruSeq Stranded mRNA, Total RNA サンプル調製キット特徴 ● ストランド情報を保持して RNA-Seq 実施可能 ● ENCODEプロジェクト, modENCODE でも利用 ● mRNA用キット - PolyA RNAをターゲットにして解析 ● Total RNA用キット - non-coding RNA解析に利用可能 - TruSeq Stranded Total RNA であれば分解されているRNAもOK - FFPEサンプルといった分解したRNAにも対応 - リボソーマルRNAを除去する Ribo-Zero試薬もキットに含む ● Input RNA量: 1
Slide 36: TruSeq Stranded mRNAワークフロー
TruSeq Stranded mRNAワークフロー RNA 40
Slide 37: TruSeq Stranded Total RNAワークフロー
TruSeq Stranded Total RNAワークフロー Ribosomal RNA RNA rRNA probe rRNA-depleted RNA rRNA depletion, fragmentation and random priming 41
Slide 38: イルミナライブラリー調製キットの価格表 (1)
イルミナライブラリー調製キットの価格表 (1) こちらは、2017年10月改訂版の「試薬消耗品価格表」を参照しています。 42
Slide 39: イルミナライブラリー調製キットの価格表(2)
イルミナライブラリー調製キットの価格表(2) こちらは、2017年10月改訂版の「試薬消耗品価格表」を参照しています。 43
Slide 40: 情報解析
7 lumina’
Slide 41: データ解析 : BaseSpace で簡単に！
データ解析 : BaseSpace で簡単に！ 主要アプリケーションを搭載 • 全ゲノム解析 • エクソーム解析 • RNA-Seq解析 • 腫瘍/正常細胞解析 45
Slide 42: BaseSpace : RNA-Seq解析関連のアプリ
BaseSpace : RNA-Seq解析関連のアプリ ※2018年1月現在 遺伝子の発現解析 二群間解析 miRNA解析 融合遺伝子検出 RNA-Seq Alignment Small RNA パネル製品の解析 Cufflinks Assembly & DE, DESeq2 TruSeq Targeted RNA, RNA Amplicon 46
Slide 43: クリック操作ですばやく実行
クリック操作ですばやく実行 ① プロジェクト名を選択 ③ 実行！ ② サンプルを選択 47
Slide 44: 解析のQC結果を確認
解析のQC結果を確認 ライブラリーの挿入配列 の長さの分布 Coding, UTR, Intron Intergenic 領域へのアラ イメンとの割合 5’ > 3’のカバレッジの均一性 48
Slide 45: 解析結果の閲覧
解析結果の閲覧 ひととおりの図の作成 結果ファイル 各遺伝子・トランスクリプトの発現量 二群間解析の結果 アライメントファイル(BAMファイル形式) cSNPの検出結果 (VCFファイル形式) 49
Slide 46: まとめ
まとめ ● 研究目的によって実験デザインは異なる - 発現解析: シングルリード、1,000万リード以上 - トランスクリプトーム解析: ペアエンド、2,500万クラスター以上 - コストはHiSeq・NextSeq使用の場合は、発現解析はおよそ2万円、トランス クリプトーム解析は5万円。 ● 解析対象のRNAの種類(mRNA、polyAを持たないnon-codig RNA、 miRNA)によって使用するライブラリー調製キットは異なる。 ● BaseSpaceを用いれば、クラウド環境でクリック作業で情報解析が 可能 → サーバーやLinuxのスキルがなくても大丈夫！ 50
Slide 47: 過去のウェビナー
過去のウェビナー http://jp.illumina.com/events/webinar.html 51
Slide 48: 過去のウェビナー RNA-Seq関連
過去のウェビナー RNA-Seq関連 イルミナウェビナー RNA-Seqシリーズ 「トランスクリプトームデータ解析戦略2014」 東京大学・大学院農学生命科学研究科・ アグリバイオインフォマティクス教育研究ユニット 門田 幸二 先生 52
Slide 49: RNAシーケンス入門ガイド
RNAシーケンス入門ガイド http://jp.illumina.com/landing/rna_sequencing_introduction_j.html 53
Slide 50: 「RNA-Seqをはじめよう」シリーズのご案内
イルミナウェビナー 「RNA-Seqをはじめよう」シリーズのご案内 絶対に失敗しない クラウドを用いた これからRNA-Seqを始める方 ライブラリー調製 簡単クリック情報解析 実験デザイン編 ライブラリー調製編 情報解析編 1月31日 2月28日 3月末予定 • これからRNA- • ワークフローは Seqを始める方に、 もちろん、実験 • 解析アプリの実 実験デザインをど を行う上での落 行方法、出力結 のように立てたら とし穴、ライブラ 果の紹介行い よいかの案内を リーの評価方 ます。 行います。 法を紹介します。 54
Slide 51: ご参加ありがとうございました
サポートウェビナーにご参加いただき ありがとうございました。 本日のセッション終了後のご質問は、 techsupport@illumina.com で承ります。 テクニカルサポート直通のフリーダイヤルも ご利用くださいませ。 0800-111-5011 59