Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (June 2017)
46 slides from Illumina's technical presentation, Jun 12, 2017
Slide 1: SAVでランの評価と改善を行う
SAV（Sequencing Analysis Viewer）で ランの評価と改善を行う Jun. 12, 2017 西田 圭伸 イルミナ株式会社 テクニカルアプリケーションサイエンティスト © 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cBot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, H
Slide 2: SAV（Sequencing Analysis Viewer）とは？
SAV（Sequencing Analysis Viewer）とは？ ランの状況をモニターしたりランのクオリティを評価するためのソフトウェア」です。 配列情報などを参照するためのものではありません 2
Slide 3: SAVのダウンロードとバージョンについて
SAVのダウンロードとバージョンについて イルミナ株式会社のホームページよりダウンロード可能です http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/sequencing_analy sis_viewer_sav.html 2つのソフトウェアのバージョンが利用できます • SAV 2.1.8 最新のもの、Genome Analyzerを除く現行のすべての機種に対応しています 一部の使われなくなった機能が廃止されています .Net 4.5.1など、最近のミドルウェアが必要になります • SAV 1.8.37 Genome Anal
Slide 4: SAVをインストールするためのPCの条件
SAVをインストールするためのPCの条件 必要なミドルウェアについて SAV2.1.8 SAV1.8.37 4
Slide 5: SAVでランのデータを参照する際に必要なデータ
SAVでランのデータを参照する際に必要なデータ Run folder (ランを実施した日付や、マシン IDが入ったフォルダ）の直下にある以下の ３つデータ – InterOp folder – runParameters.xml – RunInfo.xml イルミナよりトラブルシューティングの際 にこれらのデータの送付をお願いすること がございます Thumbnail_Imagesフォルダがあれば、画 像を見ることもできます 5
Slide 6: RunのデータをSAVで参照するための操作 (SAV2.1.8)
RunのデータをSAVで参照するための操作 (SAV2.1.8) Run folderの場所を指定しRefreshを押す。もしくはBrowseで参照する 6
Slide 7: 装置によって、SAVのデータの見た目が異なります
装置によって、SAVのデータの見た目が異なります MiSeq NextSeq MiniSeq HiSeq High Output 7
Slide 8: ランの評価で特に重要となる項目
ランの評価で特に重要となる項目 クオリティスコア（％Q30） クラスター密度 Passing Filter（PF） Phasing/Prephasing FWHM PhiX Aligned% 8
Slide 9: ランの評価で特に重要となる項目
ランの評価で特に重要となる項目 クオリティスコア（％Q30） クラスター密度 Passing Filter（PF） Phasing/Prephasing FWHM PhiX Aligned% 9
Slide 10: クオリティスコア（Q30）とは？
クオリティスコア（Q30）とは？ Phred 塩基が誤ってコール ベース Q- Q Score = Phreadクオリティス Quality Score される確率 コールの score コアベースコールにおけるエ 正確性 ラー率の予測指標 10 1 in 10 90% Q10 20 1 in 100 99% Q20 ％Q30とは、クオリティスコア 30 1 in 1000 99.9% Q30 がQ30以上だった塩基の割合 40 1 in 10000 99.99% Q40 Understanding Quality Score: http://support.illumina.com/cont
Slide 11: Analysisタブ：QScore Distribution
Analysisタブ：QScore Distribution 11
Slide 12: Analysisタブ：Data By Cycle
Analysis2 7 : Data By Cycle Analysis Viewer Run Folder: Browse Analysis | Imaging | Summary | Tile Status | TruSeq Controls | Indexing | Status Extracted: 141 Called: 141 Scored: 141 Flowcell Chart Data By Cycle QScore Distribution > Intensity 1 on Surface Cycle Base A Intensity All Lanes Both Surfa
Slide 13: Summaryタブ
Summary4 7 Run Folder: ( Analysis | Imagit Summary Run Summary Level ry i Read 1 26585 265.85 Read 2 265.85 265.85 Non-indexed Total 531.69 531.69 Total 53169 531.69 Read 1 Density bane Ties (Kimm2) 1 6 1027 +/-29 2 6 1026 +/-29 3 6 1026 +/-30 4 6 1026 +/- 32 5 6 1025 +/-31 6 96 1027 +/-32 7 6 1029
Slide 14: それぞれの装置における%>=Q30の仕様
それぞれの装置における%>=Q30の仕様（PhiXを使用したデータです） 2x50bp 2x75bp 2x100bp 2x125bp 2x150bp 2x250bp 2x300bp NovaSeq ≥85% N/A ≥80% N/A ≥75% N/A N/A HiSeq ≥85% N/A ≥80% N/A N/A N/A N/A HO V3 HiSeq ≥85% N/A ≥80% ≥80% N/A N/A N/A HO V4 HiSeq ≥85% N/A ≥80% N/A N/A ≥75% N/A RR V2 NextSeq N/A ≥80% N/A N/A ≥75% N/A N/A V2 M
Slide 15: クラスター密度を適正に保ちクオリティスコアの低下を防ぐ
クラスター密度を適正に保ちクオリティスコアの低下を防ぐ 最適クラスター密度は装置、用いるライブラリーによって異なる 塩基バランスに偏りのあるライブラリーを用いる場合には、低めのクラスター密度に設 定していただくことを推奨 （PhiXの場合） 15-20 https://support.illumina.com/bulletins/2016/10/phix-loading-concentrations-for- validation-runs-on-illumina-sequencing-platforms.html 15
Slide 16: 塩基バランスの偏ったライブラリーでクオリティスコアの低下を防ぐには？
塩基バランスの偏ったライブラリーで クオリティスコアの低下を防ぐには？ 塩基バランスの偏ったライブラリーを用いられる場合は、適切なラン条件を 用いること – 16S metagenome, PCR-ampliconサンプルなど – クラスター密度を低めに設定していただく – PhiXを添加して、ライブラリーの塩基バランスを整えていただく – Low Diversityサンプルのシーケンスランを成功させるコツ（2017/3/15 サポート ウェビナー） http://www.illuminakk.co.jp/documents/pdf/2013_illumina_techsupport_sess
Slide 17: ランの評価で特に重要となる項目
ランの評価で特に重要となる項目 クオリティスコア（％Q30） クラスター密度 Cluster Passing Filter（PF） Phasing / Prephasing FWHM PhiX Aligned% 17
Slide 18: 適正なクラスター密度を狙って、実験を行うことが重要
適正なクラスター密度を狙って、実験を行うことが重要 適正なクラスター密度でないと、Q Scoreが低くなったり – 推奨クラスター密度（PhiXの場合） https://support.illumina.com/bulletins/2016/10/phix-loading-concentrations- for-validation-runs-on-illumina-sequencing-platforms.html ％Cluster Passing Filter (% Cluster PF）が得られない可能性がある – Cluster Pass Filterを最適化するには（2013/11/
Slide 19: Analysisタブ：Data by Lane
Analysis # 7 : Data by Lane jumine Sequenchg Anal Sequencing Analysis Viewer Run Folder: | Browse Analysis | Imaging | Summary | Tile Status | TruSeq Controls | Indexing | Status Extracted: 141 Called: 144 Scored: 141 Flowcell Chart Data By Cycle >), QScore Distribution > Intensity Intensity Top Sur
Slide 20: Summaryタブ
Summary4 7 Projected Total Yield Alig (Gs) (%) 265.85 0.68 265.85 067 531.69 0.68 631.69, 068 Density (Kimm2) 1027 +/- 29 1026 +/- 29 1026 +/- 30 1026 +/- 32 1025 +/- 31 1027 +/- 32 1029 +/- 31 4027 +/- 33 Density (Kimm2) 1027 +/-29 1026 +/- 29 1026 +/- 30 1026 +/-32 1025 +/-31 1027 +/-32 1029 +/-31
Slide 21: imagesタブ
imagesタブ 塩基ごとに画像を切り替えられる 21
Slide 22: クラスター密度が高すぎる画像の例
クラスター密度が高すぎる画像の例 クラスター同士が密接している、または重なり合っている S/N比が低くなるために、フォーカスが取りにくくなり、フォーカスエラーの 原因になることもあります – MiSeqでフォーカスエラーが出た！どうしたら良い？（2014/7/25 サポー トウェビナー） http://www.illuminakk.co.jp/documents/pdf/2014_techsupport_session8.pdf 22
Slide 23: MiSeqのオーバークラスターの診断と対策についてのTech noteのご紹介
MiSeqのオーバークラスターの診断と対策についての Tech noteのご紹介 https://support.illumina.com/content/dam/illumina- marketing/documents/products/other/miseq-overclustering-primer-770-2014-038.pdf 23
Slide 24: ランの評価で特に重要となる項目
ランの評価で特に重要となる項目 クオリティスコア（％Q30） クラスター密度 Cluster Passing Filter（PF） Phasing/Prephasing FWHM PhiX Aligned% 24
Slide 25: Phasing/Prephasingについて
Phasing/Prephasingについて Sequencing は化学反応で進むので、一部の塩基が①遅れたり、逆に②進みすぎたりする → 前後の塩基の情報から補正を行う ①反応が遅れたDNA 理想的に反応しているDNA ②反応が進みすぎたDNA Phasing Prephasing 3’ 5’ 1塩基 反応が進む向き G C C C C C A 3’ 5’ 25
Slide 26: Phasing/Prephasingについて
Phasing/Prephasingについて Phasing/Prephasingの値がそれぞ れ、~0.5%であれば正常 PhasingとPrepasingは酵素反応や 試薬Deliveryの失敗を補正する – 試薬のラインのコンタミ （Washが不十分） – 室内温度 – 装置のFC・Reagent Chillerの 温度 – 問題のある試薬 塩基バランスの悪いライブラリー の場合、正しく算出されない場合 がある 26
Slide 27: Summaryタブ
Summary4 7 Projected Total Yield Aligned Error Rate _ Intensity @) (%) (%) Cycle 1 265.85 068 = 0.33 6548 265.85 067 = Ost 11529 631.69 06s 0.42 9039 531.69, 068 = 0.42 9039 Den: Cluster PF PhasiPrephas (K/imm2) (%) (%) 1027 +1-29 93.50 +-0.95 0.116 /0.155 1026 +/- 29 93.17 +/-0.98 0.113 /0.155 1026
Slide 28: ランの評価で特に重要となる項目
ランの評価で特に重要となる項目 クオリティスコア（％Q30） クラスター密度 Cluster Passing Filter（PF） Phasing/Prephasing FWHM PhiX Aligned% 28
Slide 29: FWHMとは？
FWHMとは？ FWHM: Full Width Half Max – フォーカスがうまく撮れているがどうかの指標になる – Intensityが最大値の半分の時のクラスターの幅 ぼんやりと大きなクラスター 明るくシャープなクラスター 29
Slide 30: Analysisタブ：Data By Cycle
Analysis2 7 : Data By Cycle jueneng Run Folder: Analysis | Imaging | Summary | Tile Status | TruSeq Controls | Indexing | s- Intensity 4 Top Surface Vv cyde 1 30 Extracted: 141 Flowcell Chart Called: 141 Scored: 141 Intensity ‘Top Surface Cycle 1 Base A 5000 & 0 5 0 F 0 4200 4000 Fy 0 2 a 60 80 100
Slide 31: FWHMとは？
FWHMとは？ FWHM: Full Width Half Max – 数値は、ライブラリーの長さに依存するが、通常は2～4の間で推移する – 通常はほぼ水平に推移する。スパイクや、ランの途中から激しく上下す る場合はフォーカスが取れていない可能性がある 正常なランのFWHM フォーカスに異常のあるランのFWHM 31
Slide 32: ランの評価で特に重要となる項目
ランの評価で特に重要となる項目 クオリティスコア（％Q30） クラスター密度 Cluster Passing Filter（PF） Phasing/Prephasing FWHM PhiX Aligned% 32
Slide 33: PhiX aligned %とは、
PhiX aligned %とは、 読まれた配列は、自動でPhiXへのアライメントが行われる。その際にアライメ ントされた配列の割合がPhiX aligned %になる アライメントされた配列の割合がSummary Table の項目に表示される ランに問題があれば期待される値から大きく外れることもある オーバークラスターでは、正常な数字が出ないので注意が必要 33
Slide 34: PhiX aligned %の利用方法
PhiX aligned %の利用方法 例 MiSeq V3 試薬をご利用の場合 – 100%のPhiXで、15pMの入力の場合、1200K/mm2程度のクラスタ密度にな ることが予想される ※±2割程度クラスタ数が変動することはよくあります – 100%のPhiXを15pMにしたものを、体積比にして20%混ぜ入れたものをラ ンした場合、20%程度の PhiX aligned %になることが理想 全体的にクラスタ数が少ないが PhiX aligned %が予想より高い場合 – ユーザライブラリのクラスタ数が少ない。定量がうまくいっていないか、 ユーザライブラリがクラスタができにくい特性がある
Slide 35: 実際にランのよくあるトラブルのランのデータを３つ見てみましょう！
実際にランのよくあるトラブルのランのデータを ３つ見てみましょう！ 35
Slide 36: Case 1＿MiSeq V3試薬（300PE run）
Case 1＿MiSeq V3試薬 （300PE run） 9サイクル目より激しくIntensityが低下 Q scoreが算出されていない 36
Slide 37: Case 1＿MiSeq V3試薬（300 PE run）
Case 1＿MiSeq V3試薬 （300 PE run） Cluster Densityは推奨の密度を保っている（MiSeq v3：~1400K/mm2） しかし、PFの値はゼロ、Q scoreが算出されていない 37
Slide 38: Case 1＿MiSeq V3試薬（300 PE run）
Case 1＿MiSeq V3試薬 （300 PE run） 画像を確認するとオーバークラスター 最初の数サイクルでIntensityが下がるのは オーバークラスターの典型的な症状 オーバークラスターの際にはクラスター密 度は正しく計算されていないことがある 38
Slide 39: Case 2＿HiSeq V3 High Output（100PE run）
Case 2＿HiSeq V3 High Output（100PE run） Read2のIntensityに乱れ PF、Q scoreにも低下がみられる 39
Slide 40: Case 2＿HiSeq V3 High Output（100PE run）
Case 2＿HiSeq V3 High Output（100PE run） Q score（>=Q30）においても Read1と比較して、Read2で激しい 低下が見られる 40
Slide 41: Case 3＿HiSeq V3 High Output（PE run）
Case 3＿HiSeq V3 High Output（PE run） 推奨よりも高いクラスター密度（ HiSeq V3 High Output：750 ~ 850K/mm2） オーバークラスターの際にはRead2の方が 激しくQ scoreを落とす傾向がある （クラスターサイズがRead1よりも大きくな るため） 41
Slide 42: Case 3＿MiSeq V2試薬（250 PE run）
Case 3＿MiSeq V2試薬 （250 PE run） Intensityに乱れ PF、Q scoreにも低下がみられる 42
Slide 43: Case 3＿MiSeq V2試薬（250 PE run）
Case 3＿MiSeq V2試薬 （250 PE run） T A CG C A GC A G T Whole Genome Sampleの例 43
Slide 44: Case 3＿MiSeq V2試薬（250 PE run）
Case 3＿MiSeq V2試薬 （250 PE run） 偏りのあるサンプルの場合は、クラスター密度の影響を受けやすくなり、 MiSeqのランで1000K/mm2を超えると激しくQ scoreを落とす MCS v2.3以上で、クラスター密度を800K/mm2程度に抑えていただき、5~20% 程度PhiXを入れていただくことを推奨 44
Slide 45: その他リソース情報
その他リソース情報 SAVサポートページ https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_softw are/sequencing_analysis_viewer_sav.html Sequencing Analysis Viewer (SAV) User Guide https://support.illumina.com/downloads/sequencing- analysis-viewer-software-guide-15066069.html 他のウェビナー録画（塩基の偏りを生じる16S metagenome解析に関する内容も
Slide 46: ご視聴くださいましてありがとうございました!
ご視聴くださいまして ありがとうございました! 本日セッション終了後のご質問は、 techsupport@illumina.comにお問い合わせください 46