Slide 1: MIG-seq法：次世代シーケンサーを用いた手軽なゲノムワイド塩基配列分析
イルミナiSchoolウェビナー（プロフェッショナル） 2018/09/05 15:00〜16:00 MIG-seq法： 次世代シーケンサーを用いた 手軽なゲノムワイド塩基配列分析 陶山佳久 東北大学大学院農学研究科
Slide 2: 本日の話題
本日の話題 1. MIG-seq法の概要 2. 研究例の紹介 3. 手法の改良 4. iSeq100の利用 5. その他の応用
Slide 3: 本日の話題
本日の話題 1. MIG-seq法の概要 2. 研究例の紹介 3. 手法の改良 4. iSeq100の利用 5. その他の応用
Slide 4: MIG-seq法の概要
1. MIG-seq法の概要 MIG-seq Multiplexed ISSR Genotyping by sequencing (Suyama & Matsuki, 2015） Scientific Reports 5: 16963 注：最新プロトコルは原著論文版から一部変更してあります。
Slide 5: MIG-seq: Multiplexed ISSR Genotyping by sequencing
1. MIG-seq法の概要 MIG-seq: Multiplexed ISSR Genotyping by sequencing PCRのみによってゲノム縮約ライブラリーを構築し、NGSを用いた塩基配列分析に よりSNPジェノタイピング等を行うための新しい手法 a) 1st PCR SSR Anchor for the 2nd PCR primers Forward primer Anchor Multiplexed PCR with tailed ISSR primers Genome DNA PCR Genome DNA SSR ISSR region SSR Reverse prime
Slide 6: RADseq法との違い
1. MIG-seq法の概要 RADseq法との違い ゲノム内の縮約方法 （「ほどほど」の領域を取り出して分析対象とする方法） が違う。 RAD：制限酵素 v.s. MIG：PCR
Slide 7: 背景 RADの問題点
背景 RADの問題点 制限酵素処理を行う ↓ 十分な量の高品質DNAが必要 ↓ そもそもRADほどのデータは必要ない場合も。 非モデルの野外サンプルでは 「無理！」というケースがしばしばある。 ＜その他の例＞ 微生物 標本 古代試料 例）熱帯で採取した劣化サンプル 例）希少種で、ごく少量の枯死寸前の 葉などしか採取できない場合
Slide 8: 背景 RADに代わる新手法
背景 RADに代わる新手法 何か解決方法はないのか？ ↓ 制限酵素を使わずにゲノムの一部を選び出せばいい （縮約ゲノムライブラリーの作成法） ↓ PCRだけでうまく選び出す方法はないか？ ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)
Slide 9: 背景 ISSR
背景 ISSR Forward Primer SSR Anchor SSRに挟まれた領域をPCR増幅する GTGTGTGTGTGTTC SSR 3’･･CACACACACACAAG･････････････CTTGTGTGTGTGTG･･･････5’ 5’･･･GTGTGTGTGTGTTC･････････････GAACACACACACAC･･････3’ GTGTGTGTGTGTTC Anchor PCR 産物 Reverse Primer Tsumura et al. 1996より これをマルチプレックスにしてもっと多数の領域を増幅してライブラリーにすればよい
Slide 10: MIG-seq法の概要 3ステップ
1. MIG-seq法の概要 a) マルチプレックスPCRによる多数のSSR間領域のPCR増幅 b) Tailed PCRによる配列付加 c) サイズ選抜・定量（qPCR）、NGS（MiSeq）によるラン a) 1st PCR SSR Anchor for the 2nd PCR primers Forward primer Anchor Multiplexed PCR with tailed ISSR primers Genome DNA PCR Genome DNA SSR ISSR region SSR Reverse primer Highly reduced representati
Slide 11: Step #1: 1st PCR（多数のSSR間領域のPCR増幅）
1. MIG-seq法の概要 Step #1: 1st PCR（多数のSSR間領域のPCR増幅） 「ほどほどに」多数の領域をゲノム内から引っ張り出す。 a) 1st PCR SSR Anchor for the 2nd PCR primers Forward primer Anchor Multiplexed PCR with tailed ISSR primers Genome DNA PCR Genome DNA SSR ISSR region SSR Reverse primer Highly reduced representation library ユニバーサルなプライマーセットに
Slide 12: Step #1: 1st PCR primer set-1
1. MIG-seq法の概要 Step #1: 1st PCR Table 1. Sequences of MIG-seq primer set-1 for the 1st PCR Name Sequences (5¢–3¢) Forward primers: (Tail + anchor: CTG) + SSR + anchor (ACT)4TG-f CGCTCTTCCGATCTCTGACTACTACTACTTG (CTA)4TG-f CGCTCTTCCGATCTCTGCTACTACTACTATG (TTG)4AC-f CGCTCTTCCGATCTCTGTTGTTGTTGTTGAC (GTT
Slide 13: Step #1: 1st PCR primer sets 1 & 2
1. MIG-seq法の概要 一応、２つのセットを作った。 座数が足りない場合等に Step #1: 1st PCR 使うことができる。 Tailed ISSR primers set-1 & 2 Primer set-1 Primer set-2 Table 1. Sequences of MIG-seq primer set-1 for the 1st PCR Supplementary Table 1. Sequences of MIG-seq primer set-2 for the 1st PCR Name Sequences (5¢–3¢) Forward primers: (Ta
Slide 14: Step #1: 1st PCR
1. Brief introduction of MIG-seq Step #1: 1st PCR Calophyllum inophyllum 1st
Slide 15: Step #2: 2nd PCR (Tailed PCR)
1. MIG-seq法の概要 Step #2: 2nd PCR (Tailed PCR) Tailed PCRによって、1st PCR産物の両端にシーケンシング に必要な配列とインデックス配列を付加する。 Indexed forward primer Index 1st PCR product Index Indexed reverse primer New version of the 2nd PCR primers Index Forward AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACxxxxxACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG (in
Slide 16: Step #3-1,2：サイズ選択、定量
1. MIG-seq法の概要 Step #3-1,2：サイズ選択、定量 1st PCR 2nd PCR Pool, (Multiplexed Tailed PCR) (Tailed PCR + Index) Size selection (350–800 bp) → → Pippin Prep (Sage Science) Amplified genome region (ISSR) P5 Read-1 seq. primer SSR SSR Read-2 seq. primer P7 29 5 33 3 12 2 ca. 180–630 2 12 3 34 9 24 ライブラリーの構造
Slide 17: サイズ選択、定量、NGSラン
1. MIG-seq法の概要 Step #3-1: サイズ選択 (350–800 bp) あるいは 磁性ビーズ法 ゲルカセット Pippin Prep (SPRIselect or AMPure XP, Beckman Coulter) (Sage Science) Step #3-2: 定量 定量用キット qPCR Step #3-3: NGSラン MiSeq用キット NGS (MiSeq等）
Slide 18: Step #3-3: MiSeq Run, Step #4: データ解析
1. MIG-seq法の概要 Step #3-3: MiSeq Run Step #4: データ解析 MiSeqを用いた1ラン （96〜192サンプル）の平均的データ量 生リード数： 〜6000万リード SNP座数： ~10,000 SNPs データ解析ソフト： Stacks（Catchen et al 2011）
Slide 19: 時間と費用（MiSeqを用いた標準的な分析例）
1. MIG-seq法の概要 時間と費用（MiSeqを用いた標準的な分析例） １日目 1) 1st PCR 96–192 サンプル マルチプレックスPCR (前情報不要) 2) 2nd PCR 必要な配列を付加 時間：３日間 ２日目 1) 全サンプルを混合 ライブラリ構築: 1日 サイズ選択、定性・定量 NGSラン: 1日 2) 一度にNGSでラン データ解析:1日 ３日目 費用：約15万円 データ解析
Slide 20: 本日の話題
本日の話題 1. MIG-seq法の概要 2. 研究例の紹介 3. 手法の改良 4. iSeq100の利用 5. その他の応用
Slide 21: 研究例の紹介
研究例の紹介 1) 個体間レベル ジェネット（クローン）識別 2) 集団間レベル 集団遺伝・分子系統地理 3) 近縁種間レベル 雑種識別 4) 種（あるいは属）間レベル 系統関係
Slide 22: 本日の話題
本日の話題 1. MIG-seq法の概要 2. 研究例の紹介 3. 手法の改良 4. iSeq100の利用 5. その他の応用
Slide 23: 異なるPCR条件下における生産性・再現性試験
3. 手法の改良（１） 異なるPCR条件下における生産性・再現性試験 Step #1: 1st PCRの条件検討 ・PCRキット (original: TaKaRa Multiplex PCR Assay Kit Ver. 2) ・プライマー濃度 (original: 0.2 µM) ・アニーリング温度 (original: 48°C）
Slide 24: 異なるPCR条件下における生産性・再現性試験
3. 手法の改良（１） 異なるPCR条件下における生産性・再現性試験 材料: 異なる8種 生産性 ＝共通座（スタック）数 ÷ リード数 １サンプル 再現性 ＝サンプル間の不一致座数 ÷ 全座数 ２チューブでPCR
Slide 25: 1st PCRのアニーリング温度
3. 手法の改良（１） 異なるPCR条件下における生産性・再現性試験 １） 1st PCRのアニーリング温度 Step #1: 1st PCR Profile of the 1st PCR 48°C 94°C 1 min. vs. (18–25 cycles) 94°C 30 sec. XX°C 1 min. 28, 33, 38, 43, 53°C 72°C 1 min. 72°C 10 min.
Slide 26: Step #2: 2nd PCRの条件等検討
3. 手法の改良（２） Step #2: 2nd PCRの条件等検討 ・PCRサイクル ・インデックス （シングル→デュアル） ・その他 Indexed forward primer Index 1st PCR product Index Indexed reverse primer
Slide 27: インデックス（シングル→デュアル）
3. 手法の改良 2) インデックス （シングル→デュアル） Fig. Schematic diagram of MIG-seq 2nd PCR 2nd PCR primers Forward AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG (Common) Reverse CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGCGTGCTCTTCCGATCTGAC Index シングルインデックスによる解析で実際に検出された振り分け間違いの例 ： 358 ± 432 re
Slide 28: その他の改変：デュアルインデックス
その他の改変 2)インデックス （シングル→デュアル） デュアルインデックスによる解析で実際に検出された振り分け間違い ： 1.6 ± 12.5 reads / index New version of the 2nd PCR primers Index Forward AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACxxxxxACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG (index) Reverse CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC (index
Slide 29: データ解析手法の改善
3. 手法の改良（３） データ解析手法の改善 ＜改良法１＞ ＜これまで＞ ・最小デプスを下げた（m=3）解析 ＝Stacksのデフォルト設定 ・解析ソフトStacksを使った 「厳しめ」の解析 ＜改良法２＞ １）Stacksで各サンプルの座を抽出 ２）全サンプルでリファレンスを作製 ３）リファレンスに各サンプルの座を 貼り付ける ＜その効果＞ ・座数と解析可能サンプル数の増加 ・正確性の向上
Slide 30: 本日の話題
本日の話題 1. MIG-seq法の概要 2. 研究例の紹介 3. 手法の改良 4. iSeq100の利用 5. その他の応用
Slide 31: iSeq 100システム
4. iSeq100の利用 iSeq 100システム 400万リード、1.2GB/ランのNGSが驚きの300万円台 400万 9–17 hr リード ラン時間 1.2 Gb 2x150 bp アウトプット ペアエンドリード iSeq 100 システム本体 3,900,000円 iSeq 100 i1 試薬 400万リードのシーケンス試薬 1キットパッケージ or 4キットパッケージ 110,000円 415,000円 価格は税抜です。 2018年4月時点の価格です。 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. イルミ
Slide 32: iSeq100を用いたMIG-seqライブラリーのラン 累計Q30
4. iSeq100の利用 図 iSeq100を用いたMIG-seqライブラリーのランにおける 累計Q30（以上）平均値の変化 iSeq100i1 Reagent (300 Cycles)による１ランにより48サンプルを分析。
Slide 33: iSeq100を用いたMIG-seq分析により得られたSNP数
4. iSeq100の利用 表 iSeq100を用いたMIG-seq分析により７分類群の生物から得られたSNP数 最小リード 最大リード 材料 サンプル数 集団等 総リード数 SNP数 数 数 動物プランクト 8 ２地域 1,151,360 120,052 174,201 2,974 ン アノール 8 ２地域 835232 79,080 128,729 1,222 スギ 8 4地域 1,008,344 98,999 143,518 5,489 アツモリソウ属 8 ２地域 944,908 101,985 131,681 2,338 キスゲ類 8 2近縁種 1,101,455 114,989 18
Slide 34: iSeq100およびMiSeqによるSNP数の比較
4. iSeq100の利用 1.200 1.000 MiSeq SNP数／（リード数×リード長） iSeq100 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 図 iSeq100およびMiSeqを用いたMIG-seq分析により７分類群の生物から 得られたSNP数の比較 iSeq100： iSeq100i1 Reagent (300 Cycles)による１ランにより48サンプルを分析。 MiSeq： MiSeq Reagent Kit v3 (150 Cycles)による１ランにより48サンプルを分析。
Slide 35: 本日の話題
本日の話題 1. MIG-seq法の概要 2. 研究例の紹介 3. 手法の改良 4. iSeq100の利用 5. その他の応用
Slide 36: まとめ: MIG-seqの特徴
まとめ: MIG-seqの特徴 長所 ・低品質／微量DNAの利用が可能 ・早い（３日間） ・簡単（2回のPCRとNGSランのみ） ・安い（1サンプル750〜1500円程度） 短所 ・数万座以上の解析には向かない ・SSR近傍の配列解析に限定される 向いている研究 ・非モデル野外生物の集団遺伝 ・種・品種・雑種・クローン識別 ・種間比較 MIG-seq法により、大まかな遺伝的情報の取得が可能 →クローン識別 →遺伝的集団構造解析 →遺伝的多様性評価 →種間関係解析 よりよい研究にお役立ていただければ幸いです。