Slide 1: 環境DNA分析のご提案
環境DNA分析のご提案 イルミナ株式会社テクニカルスペシャリスト 小林孝史 2019/09/02 © 2018 Illumina, Inc. All rights reserved.
Slide 2: 環境DNA分析のご提案
環境DNA分析のご提案 ● 環境DNAとは？ ● 環境DNA分析から分かること ● 環境DNA解析に対応するイルミナ次世代シーケンサー 2
Slide 3: 環境DNAとは？
環境DNAとは？ ● 環境DNAとは環境中に放出された（一般的には細胞外と考えられ る）生物由来のDNAの総称 ● 環境DNAの配列を解析することで、 その環境に存在していた生物 種や存在量を推定することができる ● 環境DNAは一定期間（48時間程度）を経て分解消失するので経時 的な解析が可能である 古代生物 哺乳動物 鳥類 魚類 昆虫 植物 微生物などに適応 食性調査も可能 Thomsen et al. Biological Conservation 183, (2015), 4-18 3 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/
Slide 4: 近年の環境DNA（メタ）バーコーディング解析の広がり
近年の環境DNA（メタ）バーコーディング解析の広がり ● 植物および水中生物の解析 が多い傾向 - https://www.frontiersin.org/article s/10.3389/fevo.2018.00134/full 4 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Slide 5: 世界での解析例
世界での解析例 ● オーストラリア・カーティン大学 のMichael Bunce教授のイ ンタビュー - NextSeq/MiSeq/iSeq 100を環 境DNA解析に使用 - メタバーコーディングに加 え、メタ16S rRNA、メタ ショットガン解析を組み合わ せた解析を実施 https://jp.illumina.com/science/customer-stories/icommunity-customer-interviews-case- studies/bunce-curtin-interview-edna-nextseq-miseq-iseq.html 5 For Researc
Slide 6: 定量PCR法と次世代シーケンサーを使用したメタバーコーディング法
定量PCR法と 次世代シーケンサーを使用したメタバーコーディング法 環境サンプルからのDNA抽出ステップは変わらない ● 定量PCR法 - 特定の種を特異的に検出するのに向く - 比較的少インプットからの解析が可能 - 多数の種を検出する場合、プローブの設計が難しい、ウェル数が多 く実験が煩雑 ● メタバーコーディング法 - 複数の種を網羅的に検出するのに向く - 予想していない種を含む多数の種の検出が可能 - 定量PCRに比べると定量性が低い（インラインコントロールなどを 使用することにより軽減可能） 6 For Research Use Only. Not for use in diagn
Slide 7: 次世代シーケンサーを使用した環境DNA解析の主なステップ（環境水を例に）
次世代シーケンサーを使用した環境DNA解析の主なス テップ（環境水を例に） 一部領域だけ 全ゲノム配列を 解析 解析 環境水の採取 DNAの抽出 次世代シーケンサー でのシーケンス (配列取得) Advances in Ecological Research 58 (2018), 2018, Pages 63-99より抜粋 メタバーコーディング メタショットガン 解析 解析 7
Slide 8: 環境DNA解析に使用される卓上型次世代シーケンサー
環境DNA解析に使用される卓上型次世代シーケンサー iSeq 100 NextSeq 550 システム MiniSeqシステム MiSeqシステム システム 本体価格 390.4 万円 865 万円 1,730 万円 4,810 万円 データ量 1.2 Gb 7.5 Gb 15 Gb 120 Gb コスト/ 10万 2,750 円 1,464 円 1,454 円 336 円 クラスター (40 sample) (196 sample*) (196 sample**) (960 sample***) ラン時間 7－17 時間 7－24 時間 5－55 時間 11－29 時間 最大クラス 400
Slide 9: 日本での活動の例
日本での活動の例 ● 日本バーコードオブライフ・イニシアティブ (~2016) - 世界のコンソーシアムinternational Barcode Of Life (iBOL)と連携 - http://www.jboli.org/ ● 環境DNA学会の設立 (2018~) - http://ednasociety.org/ - イルミナMiSeqを使用した魚類メタバーコーディングのユニバーサル プライマー、および解析系として「MiFish」を発表 - MiFish領域を含む魚類のミトコンドリアゲノムの配列をデータベース 化したMitoFish, MiFish pipelineを発表 - 産学の
Slide 10: 解析例） MiFish: 環境水サンプルからの魚類同定
解析例） MiFish: 環境水サンプルからの魚類同定 ● 2回PCRをしてMiSeqシステムで解析する簡単なワークフロー ● ターゲット領域は163-185bpのミトコンドリアDNA 12S rRNA領域 ● 880種のミトコンドリア全長のデータ、および160種のミトコンドリアの一部 のデータ (2013年)から設計されたユニバーサルプライマー Miya et al. R Soc Open Sci. 2015 Jul 22;2(7):150088 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4632578/ より抜粋 10
Slide 11: 魚種の特定のためのMiFishプライマーの選定
魚種の特定のためのMiFishプライマーの選定 ● 千葉県立博物館 宮正樹先生らが選定 - 12S rRNAやCOX I領域の中から選定→12S rRNAの一部 岩崎渉 他 2016 実験医学 34 (1), 103-107 より 11
Slide 12: MiFish pipelineで出力されるデータ例
MiFish pipelineで出力されるデータ例 ● htmlレポートとして出力され、配列情報に触れることなく解析可能 Sato et al. Mol Biol Evol. 2018 Jun; 35(6): 1553–1555. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5967551/ より抜粋 12
Slide 13: 環境DNAメタバーコーディング解析の応用例
環境DNAメタバーコーディング解析の応用例 ● メタバーコーディングに使用される ユニバーサルプライマー - BOLDなどの国際コンソーシアム - MiFish (2016), MiMammal (2017), MiBird (2018), MiDeca (2019)…など ● 環境DNA調査・実施マニュアル、 技術セミナー（環境DNA学会） - 定量PCR法、メタバーコーディング 法の両方を網羅 - 必要準備品、装置なども含め記載 - http://ednasociety.org/manual 13
Slide 14: メタバーコーディングに使用する次世代シーケンサーの選び方
メタバーコーディングに使用する次世代シーケンサー の選び方 ● MiFishプライマー解析であれば300 cycleキットを使用 ● 一部のバーコード（今後開発されてくるものも含む）に対しては600 cycleキットを使用 - どのような種類を解析したいかによって次世代シーケンサーの種類 は変わる - 一度に複数サンプルを混ぜて解析できる（目安は1サンプル当たり10 万リード程度←環境条件によって変わる） - 1サンプルに必要なクラスター数（＝断片数）を決める ● 標準化プロトコールで使用されているのは現状MiSeq （2019年現 在） ● ラン間のキャリーオーバーが少ないiSeq100 1
Slide 15: 12S rRNA 配列解析 ワークフロー（MiFishを例）
12S rRNA 配列解析 ワークフロー（MiFishを例） サンプル ライブラリー シーケンス データ解析 抽出 調製 最適なゲノムDNA 2ステップPCRで、 サンプルあたり MitoFish- MiFish 抽出キットで抽出 163-185bpのミトコン 100,000リードを産出 pipelineを用いて魚種を （論文などを参照） ドリアDNA 12S rRNA 同定 領域を増幅 15
Slide 16: まとめ
まとめ ● イルミナ次世代シーケンサーは環境DNA解析の メタバーコーディング解析に使用される ● 先行論文、環境DNA学会のマニュアルなどから プロトコールを選定・確立 ● バーコードの長さによってシーケンサーを選定 ● 参考書籍 - Environmental DNA: For Biodiversity Research and Monitoring - 海洋と生物 234 Vol.40-No.1 2018 - オンラインジャーナル “environmental DNA” https://onlinelibrary.wiley.com/journal/26374943 - 環境DNA調
Slide 17: イルミナウェブサイトの関連情報（2019年9月時点）
イルミナウェブサイトの関連情報（2019年9月時点） ● 環境DNA特集ページ - https://jp.illumina.com/destination/s/environmental-dna.html ● お客様インタビュー 生物多様性の変化を見ることのできる強力なレンズとなり得るeDNAシーケンス - https://jp.illumina.com/science/customer-stories/icommunity-customer-interviews-case- studies/bunce-curtin-interview-edna-nextseq-miseq-iseq.html
Slide 18: ご清聴ありがとうございました。
ご清聴ありがとうございました。 お問合せは contactJPN@illumina.com まで 18