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Illumina — Technical Presentation (July 2018)

57 slides from Illumina's technical presentation, Jul 25, 2018

  1. Slide 1: Illumina Experiment Manager (IEM) の使用方法 v1.15.1のご紹介

    サンプルシート作成ツール: Illumina Experimental Manager (IEM) の使用方法 －最新バージョン v1.15.1 のご紹介－ 上利 佳弘 フィールドアプリケーション スーパーバイザー 25-Jul-2018 © 2017 Illumina, Inc. All rights reserved. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  2. Slide 2: Illumina Experiment Manager (IEM) とは？

    Illumina Experiment Manager (IEM) とは？ サンプルシートを作成するためのWindows用プログラム 各シーケンサーワークフローに対応したサンプルシートを ウィザード形式で作成できる – サンプルシートとは (MiSeq) MiSeq に指示を与えるラン設定ファイル (MiSeq 以外) Linux の bcl2fastq でイルミナ シーケンサーの最終出力である bcl を FASTQ へ 変換する際に必要となる設定ファイル 2

  3. Slide 3: 本日の Outline

    本日の Outline ● 事前準備 ● サンプルシート作成とランセットアップのワークフロー ● Index選択のベストプラクティス 3

  4. Slide 4: IEMのダウンロードとインストール

    Ae IEMOS9LYO—KEAYRK—-I GATACTGGGAA TTGGAATTAG) ; illumina’

  5. Slide 5: IEMのダウンロード：サポートをクリック

    事前準備 IEMのダウンロード： イルミナウェブサイトで「サポート」をクリック ※ 2018年7月のウェブサイト 5

  6. Slide 6: ”Analysis”をクリック

    事前準備 IEMのダウンロード： ”Analysis”をクリック ※ 2018年7月のウェブサイト 6

  7. Slide 7: “Experiment Manager”をクリック

    事前準備 事前準備 IEMのダウンロード: “Experiment Manager”をクリック ※ 2018年7月のウェブサイト 7

  8. Slide 8: ”Illumina Experiment Manager v1.15”をクリック

    事前準備 IEMのダウンロード: ”Illumina Experiment Manager v1.15”をクリック ※ 2018年7月のウェブサイト 8

  9. Slide 9: ”Illumina Experiment Manager v1.15.1”をクリック

    事前準備 IEMのダウンロード: ”Illumina Experiment Manager v1.15.1”をクリック ※ 2018年7月のウェブサイト 9

  10. Slide 10: IEMのインストール

    事前準備 IEMのインストール: ダウンロードしたZipファイルを解凍、 IEM.Installer(62).msiを実行 既にIEMをインストール済みのPCでは、あらかじめ旧バージョンを アンインストールしておく必要があります。 10

  11. Slide 11: セキュリティ設定によって、警告が表示される場合

    事前準備 セキュリティ設定によって、警告が表示される場合 ① 詳細情報を表示して ① 実行をクリック 11

  12. Slide 12: IEM でサンプルシートを作成する際に

    事前準備 事前準備; IEM でサンプルシートを作成する際に ● ライブラリーに関する情報を準備する - 使用したライブラリー調製キット - 各サンプルのIndexやカスタムプライマー - シーケンスするサイクル数やPaired End/Single Readなどの条 件 ● 標的領域のみをシーケンスするアプリケーションでは、 位置情報を示すイルミナ独自のマニフェストファイルが 必要になります。（MiSeq用サンプルシートの場合） ● ライブラリー調製前にIEMでサンプルシートを作成して、 設定上の問題がないかをチェックしておくことをお勧め します 12

  13. Slide 13: マニフェストファイルを指定する際の注意点

    事前準備 マニフェストファイルを指定する際の注意点 ● マニフェストファイルが必要なアプリケーション*では、 サンプルシートはMiSeq本体のIEMで作成することを推奨 *TruSight Panel製品, TruSeq Amplicon, TruSeq Exome, TruSeq Targeted RNA Expression, TruSeq Bovineなど マニフェストファイル (TruSeq Ampliconの例) 13

  14. Slide 14: IEMの起動と、初期設定の確認

    Illumina Experiment Manager Create Sample Plate Create Sample Sheet Edit Sample Plate Edit Sample Sheet 7 illumina’

  15. Slide 15: IEMの各ファイルのデフォルト保存先(MiSeq)

    事前準備 IEMの各ファイルのデフォルト保存先(MiSeq) 15

  16. Slide 16: サンプルシート作成とランセットアップのワークフロー

    サンプルシート作成と ランセットアップのワークフロー 16 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  17. Slide 17: IEM の起動

    FUTIY— ME IEM OB a Illumina Experiment Manager Create Sample Plate Create Sample Sheet Edit Sample Plate Edit Sample Sheet 7 illumina’

  18. Slide 18: Instrument Selection

    サンプルシート作成 Instrument Selection 18

  19. Slide 19: カテゴリーとアプリケーションの選択

    サンプルシート作成 MiSeq Reporterで二次解析する場合の カテゴリーとアプリケーションの選択 Category の選択 Application の選択 19

  20. Slide 20: アプリケーション一覧

    サンプルシート作成 アプリケーション一覧 TruSight Tumor 15 TruSeq Bovine TruSeq Amplicon Targeted Resequencing PCR Amplicon Metagenomics 16S rRNA Enrichment Clone Checking* Amplicon - DS, TST 26 Resequencing Small Genome Plasmids* Sequencing Assembly Targeted RNA RNA Sequencing Small RNA RNA-Seq* TruSight HLA Library Q

  21. Slide 21: Application の選択; Resequencing の例

    サンプルシート作成 Application の選択; Resequencing の例 21

  22. Slide 22: Workflow Parameters の設定

    サンプルシート作成 Workflow Parameters の設定 Run Setting Workflow Specific Setting 22

  23. Slide 23: Run Setting 詳細

    サンプルシート作成 Run Setting 詳細 試薬カードリッジのバーコードを入力 （サンプルシート名となる。ランセットアップ時に MCS が自 動的にサンプルシートを検出する。） または、ラン前にファイル名を修正する 使用したライブラリー調製キットを選択 使用したインデックスアダプターを選択 インデックスの数を選択。 インデックスリードのサイクル数はインデックスキット ごとに決まっている。 実験名 実施者名 説明事項 実施日 Paired End / Single Read シーケンスリードのサイクル数 * 必須項目 23

  24. Slide 24: Workflow-Specific Settings の比較

    サンプルシート作成 Workflow-Specific Settings の比較 Resequencing Enrichment 24

  25. Slide 25: Workflow-specific Setting: Resequencing

    サンプルシート作成 Workflow-specific Setting: Resequencing Illumina Experiment Manager Software Guide より カスタムプライマーを使用するときチェック （現在、イルミナのライブラリー調製キットをご使用の場 合はチェック不要） （Onにした場合、MiSeq Reagent Kit の Port18-20 に プライマーを分注する必要がある） Illumina の Somatic Valiant Caller を使用する (体細胞変異を検出したい場合にチェック) PCR 重複のリードにフラグを立て、Variant c

  26. Slide 26: Workflow-specific Setting

    サンプルシート作成 Workflow-specific Setting Illumina Experiment Manager Software Guide より リードを逆相補鎖に変換する(Nextera Mate Pair KitのときOn) Insertion, Deletion の部位に再度アライメントを行って Insertion, Deletion の検出感度を上げる 変異解析のクオリティの閾値 デフォルトでは「30」 出力されるVCFファイルにフラグが立つ 26

  27. Slide 27: Workflow-specific Setting

    サンプルシート作成 Workflow-specific Setting Illumina Experiment Manager Software Guide より Read1, Read2それぞれについて、アダプター配列が 読まれてきた際にアダプターから下流をトリミングする (推奨はOn) 27

  28. Slide 28: Workflow-specific Setting ①

    サンプルシート作成 Workflow-specific Setting ① Illumina Experiment Manager Software Guide より Setting Applications Description BWA-Backtrack Enrichment, 以前のバージョンの BWA aligner v0.6.1 を使用す Library QC, る。BWA-MEM v0.7.9a を使用しているMiSeq PCR Amplicon, Reporter v2.6 以降用。 Small Genome Resequencing Custom Primer カスタムプライ

  29. Slide 29: Workflow-specific Setting ②

    サンプルシート作成 Workflow-specific Setting ② Setting Applications Description Indel Realignment Resequencing, Insertion, Deletion の部位に再度アライメントを GATK Enrichment 行ってInsertion, Deletion の検出感度を上げる Flag PCR TruSeq PCR 重複のリードにフラグを立て、Variant call か Duplicates Amplicon 以外 ら除外する。 Variant Quality TruSeq 変異解析のクオリティの閾

  30. Slide 30: Workflow-specific Setting ③

    サンプルシート作成 Workflow-specific Setting ③ Setting Applications Description Reverse Resequecing, Nextera Mate Pair ライブラリのリードを逆相補鎖 Complement Library QC, FASTQ に変換する Only, ChIP-Seq K-mer size Assembly アッセンブリに使用する K-mer サイズを設定する Genome Small RNA Small RNA の際に下記のリファレンスへのパスを 設定する ・Contaminants (Human RNA Con

  31. Slide 31: Sample Selection ①

    サンプルシート作成 Sample Selection ① 31

  32. Slide 32: Sample Selection ①

    サンプルシート作成 Sample Selection ① 32 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  33. Slide 33: Sample Selection ①

    サンプルシート作成 Sample Selection ① Sample ID Index情報 33

  34. Slide 34: Sample Selection ②

    サンプルシート作成 Sample Selection ② 34

  35. Slide 35: Sample Selection ③ Finish

    サンプルシート作成 Sample Selection ③ 入力完了: Valid Finish → 終了 35

  36. Slide 36: 補足:MiSeq ReporterのReference Genomeの場所

    補足:MiSeq ReporterのReference Genomeの場所 ● MiSeq ReporterにReference Genomeを追加するには、IEMの Settingで指定したGenomeフォルダ以下の、次の階層にFASTAファ イルを置きます 1階層目のフォルダ名がIEMのドロップ ダウンリストに表示される ● 例:..¥Genomes¥Saccharomyces_cerevisiae_NCBI_build3.1¥NCBI¥ build3.1¥Sequence ¥WholeGenomeFASTA¥genome.fa 36

  37. Slide 37: サンプルシートの例

    HUT ILL — KER HUTILY— ko : Dete 2018/7/ Workflow Resequencing Application Resequencing Instrument Type MiSeq Assay TruSeq DNA PCR-Free Index Adepters TruSeq DNA CD Indexes (96 Indexes) Description Chemistry Amplicon 151 151 FlagPCRDuplicates ReverseComplement 0 VarientFilterQualityCut 30 loutputgeno

  38. Slide 38: 注意事項

    サンプルシート作成 注意事項 ● 禁則文字は使用しない ? ( ) [ ] / ¥ = + < > : ; " ' , * ^ | & . とスペースやタブ ● 全角文字は使用しない 日本語 OS の場合には注意 ● セルの値が “ ” で囲まれていないか Excel や OpenOffice ではなく、notepad などで確認 XXXXXX.csv を右クリック > プログラムから開く > notepad 38

  39. Slide 39: MiSeq でのランの準備

    ランの準備 MiSeq でのランの準備 サンプルシートを MiSeq以外で作成した場合には、MiSeq 上のデフォルト保存先にコピーして使用する D:¥Illlumina¥MiSeq Control Software¥SampleSheet サンプルシートのファイル名が試薬バーコードになってい るか確認する マニフェストファイルが必要な場合、MiSeq本体上のサン プルシートで指定した場所にファイルがあるか確認する 39

  40. Slide 40: インデックス選択のベストプラクティス

    インデックス選択の ベストプラクティス 40 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  41. Slide 41: ベストプラクティス

    ベストプラクティス ベストプラクティス ● Low Plex Pooling際の注意点について - レーンあたりに使用するサンプルの数が少ない場合、Indexリードの カラーバランスを考慮し、Indexの選択に注意する必要がある ● Unique Dual Index（UD index）の使用について - UD indexはNovaSeqやHiSeq3000/4000などのパターンフローセルを 採用している装置で発生しやすいIndex hoppingの影響を回避できる （使用を推奨） - UD Indexは最新版のIEMで選択可能 41

  42. Slide 42: Low Plex Pooling際のIndex選択の注意点

    ベストプラクティス Low Plex Pooling際のIndex選択の注意点 ● ４色蛍光検出のシーケンサーの場合 - MiSeqおよびHiSeqシリーズでは、ATGCの塩基がそれぞれ異なる蛍 光でラベルされており、蛍光の励起には以下のレーザーが使用され ます ▪ A/C塩基-----赤色レーザー ▪ G/T塩基-----緑色レーザー - Indexリードの各サイクルに、 A/C塩基およびG/T塩基がどちらも出現す ることが望ましい カラーバランスに偏りのある カラーバランスが良好なIndexの Indexの組み合わせの例 組み合わせの例 Good ! Bad ! i7 index i7 i

  43. Slide 43: Low Plex Pooling際のIndex選択の注意点

    ベストプラクティス Low Plex Pooling際のIndex選択の注意点 ● ２色蛍光検出のシーケンサーの場合 - NovaSeq、NextSeqおよびMiniSeqは、2色の蛍光のみで、塩基の検 出を行う；Cは赤、Tは緑、Aは赤と緑両方の蛍光ラベルを持ち、Gは 蛍光ラベルされていない - ２色蛍光検出のシーケンサーにおけ るそれぞれの蛍光の励起には下記の レーザーが用いられる ▪ A/C塩基-----赤色レーザー ▪ A/T塩基-----緑色レーザー 43

  44. Slide 44: Low Plex Pooling際のIndex選択の注意点

    ベストプラクティス Low Plex Pooling際のIndex選択の注意点 ● ２色蛍光検出のシーケンサーのIndex選択の注意点 - Indexリードの各サイクルで、 A/C塩基およびA/T塩基が両方出現する ことが望ましい - 全てのIndexリードの先頭２塩基がGで始まっていると、クラスター の検出に失敗し、データの出力が行われない シーケンスは可能だがカラー すべてのIndexの先頭2塩基 カラーバランスの良好な バランスに偏りのある Index がGで始まっており、データ Indexの組み合わせの例 の組み合わせの例 が出力されない例 Good ! Bad ! Bad ! i7

  45. Slide 45: Low Plex Pooling際のIndex選択の注意点

    ベストプラクティス Low Plex Pooling際のIndex選択の注意点 ● Low Plex Sample Poolingを行う際のIndexの組み合わせの推 奨例などの詳細な情報はTechnoteをご参照ください - Index Adapter Pooling Guide ● 2色蛍光検出シーケンサーのIndex poolingについての詳細情 報 - Bulletin: Library pooling guidelines for the NextSeq and MiniSeq systems 45

  46. Slide 46: Unique Dual Index（UD index）の使用について

    ベストプラクティス Unique Dual Index（UD index）の使用について ● Unique Dual Index（UD index）は、i7側、i5側のIndex配列 に重複がない Dual Index ライブラリーの構造 i5 Index i7 Index <4サンプルPoolingの例＞ 従来型Index（CD index） UD index Sample i7 index i5 index sample i7 index i5 index 1 TCGCCTTA TAGATCGC 1 CCGCGGTT AGCGCTAG 2 TCGCCTTA CTCTCTAT 2 TTATA

  47. Slide 47: Index hoppingとは

    ベストプラクティス Index hoppingとは ● 複数ライブラリーをプーリングし、シーケンスをした際にライ ブラリー間でIndex の組み換えが起こり、Demultiplexing 後の ライブラリーに、別のライブラリー由来のリードが含まれてし まう現象 47

  48. Slide 48: Index hoppingとは

    ベストプラクティス Index hoppingとは ● HiSeqX・HiSeq3000/4000、NovaSeqなどのパターンフローセルを 採用した装置で低頻度ながら発生する ● MiSeqやHiSeqシリーズなど従来型フローセルの装置で発生する頻度 はごく僅か ● その他Index hoppingの詳細については、White Paperをご参照くだ さい https://jp.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/apac/japan/documents/pdf/products/whitepapers/index- hopping-whi

  49. Slide 49: UD indexの使用でIndex hoppingの影響を回避

    ベストプラクティス UD indexの使用でIndex hoppingの影響を回避 ● UD Indexを使用したランでは、Index hoppingを生じたリードは、 Demultiplexingによって、Undermined Read（どのライブラリーに も使用していないIndexの組み合わせ）として振り分けられ、各ライ ブラリーのリードに、コンタミネーションとして混ざることがない。 49

  50. Slide 50: UD indexの製品情報

    ベストプラクティス UD indexの製品情報 ● UD Indexが選択可能なライブラリー調製キット(DNA) 型番 製品名 価格 / キット 20015962 TruSeq DNA PCR-Free LT Library Prep Kit (24 Samples) ¥116,000 20015963 TruSeq DNA PCR-Free HT Library Prep Kit (96 Samples) ¥464,000 20015964 TruSeq DNA Nano LT Library Prep Kit (24 Samples) ¥116,000 20015965 TruSeq DN

  51. Slide 51: UD indexの製品情報

    ベストプラクティス UD indexの製品情報 ● UD Indexが選択可能なライブラリー調製キット(RNA) 型番 製品名 価格 / キット 20020594 TruSeq Stranded mRNA Library Prep (48 Samples) ¥397,000 20020595 TruSeq Straned mRNA Library Prep (96 Samples) ¥794,000 20020596 TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Human/Mouse/Rat (48 Samples) ¥989,000 20020597 Tru

  52. Slide 52: 補足事項

    補足事項 52 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

  53. Slide 53: Software Guide について

    Software Guide について Illumina Experiment Manager Software Guide http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment _manager.html MiSeq Sample Sheet Quick Reference Guide http://support.illumina.com/downloads/miseq_sample_sheet_quick_refer ence_guide_15028392.html MiSeq System User

  54. Slide 54: IEM Quick Reference Card も参考になります

    ランの条件については、各調製キットのウェブ ページをご参照ください。 IEM Quick Reference Card も参考になります 54

  55. Slide 55: サンプルシートの作成 – Instrument Selection

    サンプルシートの作成 – Instrument Selection NextSeqの結果からFASTQファイルを作成 55

  56. Slide 56: NextSeqの結果からFASTQファイルを作成する方法

    NextSeqの結果からFASTQファイルを作成する方法 サポートウェビナーシリーズ2014 2014/11/14 「NextSeq 500から得られるデータのFASTQ変換」 イルミナサポートウェビナー (http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn?ws=ss) 56

  57. Slide 57: サポートウェビナーにご参加いただきありがとうございました

    サポートウェビナーにご参加いただき ありがとうございました。 本日のセッション終了後のご質問は、 techsupport@illumina.com で承ります。 テクニカルサポート直通のフリーダイヤ ルもご利用ください（AM9 – PM5）。 0800-111-5011 57

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