Illumina, Inc. · NASDAQ:ILMN
Illumina — Technical Presentation (September 2014)
33 slides from Illumina's technical presentation, Sep 16, 2014
Slide 1: RNA Seq時代到来：NextSeqが実現する簡単、高速、安価なトランスクリプトーム解析
イルミナウェビナー NextSeq 500シリーズ RNA Seq時代到来： NextSeqが実現する 簡単、高速、安価な トランスクリプトーム解析 2014年9月16日 イルミナ株式会社 シーケンシング スペシャリスト 鈴木 健介 © 2013 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, IlluminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cBot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, Genome
Slide 2: 研究トレンドはRNA Seqに移行
研究トレンドはRNA Seqに移行 100% 90% 80% Award $ - newly-funded grants: “GEX” 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 2009 2010 2011 2012 2013 RNA-seq Gene Expression Arrays ※ NIHデータベースから新規遺伝子発現解析のグラントがRNA-Seqか発現アレイかを集計 2 2
Slide 3: 急速に広がる RNA Seq 手法
急速に広がる RNA Seq 手法 2000 1500 論文数* 1000 500 0 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 年 * NCBI Pubmed を RNA-Seq で検索した結果を年ごとに集計。 3 3
Slide 4: 本日の内容
本日の内容 今なぜRNA Seq? – マイクロアレイの原理と限界 – RNA Seqの原理と長所 何故RNA-Seqをやるのか NextSeq 500が実現する簡単、高速、安価なRNA Seq – NextSeq 500紹介 – RNA Seqワークフロー – RNA Seqコスト 更に詳しく知りたい方へ 4 4
Slide 5: マイクロアレイの原理と限界
マイクロアレイの原理と限界 http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray 5 5
Slide 6: マイクロアレイの原理と限界
マイクロアレイの原理と限界 マイクロアレイ の プローブ マイクロアレイ • 遺伝子の一部分の配列からプローブを設計 • サンプルとハイブリダイゼーションさせ発現量を調べる 6 6
Slide 7: マイクロアレイの原理と限界
マイクロアレイの原理と限界 遺伝子の一部 （プローブ設計部 分） しか見ていない 7 7
Slide 8: マイクロアレイの原理と限界
マイクロアレイの原理と限界 他の遺伝子や偽遺伝子に 同じ配列があると区別できな い 8 8
Slide 9: RNA Seqの原理と長所
RNA SeqO Rt SA = ee an = = = = — b—. == a ——_-_ =—_ —. _: == = = ~ a illumina’
Slide 10: RNA Seqの原理と長所
RNA Seqの原理と長所 スプライス アイソ フォーム エクソン Poly-A付加位置の スキップ 異なる転写産物 融合遺伝子 10 10
Slide 11: 臓器特異的なスプライスアイソフォームの発現
臓器特異的なスプライスアイソフォームの発現 様々なバリエーション 11 11 Wang ET, et al. (2008) Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature 456:470–476. Fig. 2 を改変
Slide 12: アルツハイマーにおけるスプライスアイソフォーム
アルツハイマーにおけるスプライスアイソフォーム • 患者由来の脳RNA Seq : APOE の解析結果 Twine NA, et al., (2011) Whole Transcriptome Sequencing Reveals Gene Expression and Splicing Differences in Brain 12 12 Regions Affected by Alzheimer’s Disease. PLoS ONE 6(1): e16266. ※ Figure 3 の一部を抜粋
Slide 13: 癌において発現する偽遺伝子
癌において発現する偽遺伝子 13種類の癌を対象に 293 サンプルを解析 これまでの課題： 高い配列の類似性のために偽遺伝子と遺伝子の発現 を分けて解析することは困難 本論文： RNA Seqにより、偽遺伝子を区別して発現を解析 – 癌種特異的に発現している偽遺伝子の発現を観察 – 偽遺伝子の発現は転写産物全体に重要な影響を与え、細胞間の違いや癌の 進行に重要な役割を果たしていると考察 Kalyana-Sundaram S, et al,. Expressed pseudogenes in the transcriptional landscape of human cancers. 13 1
Slide 14: 癌の融合遺伝子
癌の融合遺伝子 COSMICデータベースの Curated Fusions で 208 の登録（2014年9月10日時点） http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/classic 14 14
Slide 15: RNA Seq で可能なこと
RNA Seq で可能なこと スプライスバリアントごとの発現解析 融合遺伝子の検出 アリルごとの発現解析 新規転写産物の発見、解析 Non coding RNA の解析 July 2008 - Vol 5 No 7 超微量からの発現解析 Nature Methods 5 (2008) The beginning of the end for microarrays? 幅広いダイナミックレンジ 15 15
Slide 16: 本日の内容
本日の内容 今なぜRNA Seq? – マイクロアレイの原理と限界 – RNA Seqの原理と長所 何故RNA-Seqをやるのか NextSeq 500が実現する簡単、高速、安価なRNA Seq – NextSeq 500紹介 – RNA Seqワークフロー – RNA Seqコスト 更に詳しく知りたい方へ 16 16
Slide 17: 今後の遺伝子発現解析を大きく変える NextSeq 500
今後の遺伝子発現解析を大きく変える NextSeq 500 RNA Seqに最適な次世代シーケンサー 17 17
Slide 18: プッシュボタンで操作する簡易性
プッシュボタンで操作する簡易性 バッファー 試薬カートリッジ 廃液 フローセル 18 18
Slide 19: サンプルから答えまでのワークフロー
サンプルから答えまでのワークフロー PCでデータを NeoPrep NextSeq 500 BaseSpace 閲覧 自動化装置 近日リリース予定 ライブラリー シーケンス 一次解析 二次解析 調製 RNA Seq 8 時間 18 時間 4 時間 / サンプル 時間 （ 手動 5.5 時間） （ 10 分） （ 5 分） （ハンズオン時間） （ 自動 30 分） 19 19 19
Slide 20: RNA Seq：キットの選択
RNA Seq：キットの選択 TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 No ストランド情 報に興味があ る Yes TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit No ncRNAにも 興味がある Yes TruSeq Stranded Total 細胞質だけで No RNA Ribo-Zero H/M/R なくミトコン ドリアのrRNA も除去したい Yes TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Gold 20 20
Slide 21: TruSeq RNA Sample Prep Kit ワークフロー
TruSeq RNA Sample Prep Kit ワークフロー Total RNA から poly A を使い mRNA を回 AAAAA 収 AAAAA RNA の断片化 NNNNNN ランダムプライマーを用いた cDNA 合成 NNNNNN P 2本鎖 cDNA 合成 P 1日 P A 末端修復、リン酸化、Aテイル付加 A P A インデックス付アダプターのライゲーショ T T A ン T A A T ビーズによるサイズ選択 T A T A 15サイクルPCR 21 21
Slide 22: データ解析 : BaseSpace で簡単に！
データ解析 : BaseSpace で簡単に！ 主要アプリケーションを搭載 • 全ゲノム解析 • エクソーム解析 • RNA-Seq解析 • 腫瘍/正常細胞解析 22 22 22
Slide 23: データ解析：ウェブブラウザをクリックすることで行なう
データ解析： ウェブブラウザをクリックすることで 行なう 4つのステップで実施 1. TopHat をラン 2. TopHat のQCを実施 – 必要に応じてサンプルを排除 3. Cufflinks をラン – コントロールグループの選択 1 – 比較グループの選択 2 4. グループ間を視覚化 – 遺伝子発現の相関性 3 23 23
Slide 24: 結果はエクセルとIGVで閲覧可能
tA (SLO ILEIGVCHE a BE tracking id class_code| nearest ref gene_id |gene_short_ngtss_id locus length: coverage |FPKM FPKM_conf_lo|FPKM_conf_hi| FPKM_status IDDX11L1 bed = DDX11L1 DDX11L1 TSS14844 | chr1:11873-14409 = = 0.053864, 0.0114821 0.103339|OK IWASH7P. - - IWASH7P- IWASH7P- TSS7514 jchr1:1436
Slide 25: TopHat Fusion による融合遺伝子候補のレポート
TopHat Fusion による融合遺伝子候補のレポート RNA Seq による融合遺伝子の検出 RNA Seqリードの中に cSNP や InDel を検出 25 25
Slide 26: RNA Seq: サンプルあたりのコスト試算
RNA Seq: サンプルあたりのコスト試算 アレイより安価に 解析ができるよう ライブラリー調製およびシーケンスラン試薬 に なりました！ NextSeq 解析目的例 必要リード数 サンプルあたりのコスト 遺伝子ごとの発現プロファイル解析 1000万 ¥ 18,200 （発現アレイと同等の解析） 転写産物ごとの発現プロファイル解析 2500万 x2 ¥ 36,700 (mRNA Seq) ncRNAも含んだ発現プロファイル解 析 5000万 x2 ¥ 70,000 (Total RNA Seq) 26 26
Slide 27: 高い互換性を示す RNA Seq 結果
高い互換性を示す RNA Seq 結果 HiSeq vs. NextSeq 500 27 27
Slide 28: RNA Seq : イルミナ東京ラボでの NextSeq 解析結果
RNA Seq : イルミナ東京ラボでの NextSeq 解析結 果 タカラバイオ社 市販RNAサンプル 3種 （ヒト心臓、心臓疾患、肝 臓） Ambion社 市販RNAサンプル 1種 （ヒト脳） BaseSpace プロジェクトとして データをシェアしています 28 28
Slide 29: 本日の内容
本日の内容 今なぜRNA Seq? – マイクロアレイの原理と限界 – RNA Seqの原理と長所 何故RNA-Seqをやるのか NextSeq 500が実現する簡単、高速、安価なRNA Seq – NextSeq 500紹介 – RNA Seqワークフロー – RNA Seqコスト 更に詳しく知りたい方へ 29 29
Slide 30: 4)NVEFUITEF—
4)NVEFUITEF— 30 30 illumina’ PIVT—Yay YATh AVIAVT IIA RR RHY-EA YHIVA oR-—b AVIS HAA KSRMRRDS YATFLOEVAEC Jxre+—@EAL AVIA VY CHRERR illumina’
Slide 31: 参考文献
参考文献 マイクロアレイとの比較 Liu, S., Lin, L., Jiang, P., Wang, D. & Xing, Y. A comparison of RNA-Seq and high-density exon array for detecting differential gene expression between closely related species. Nucleic Acids Res. 39, 578–588 (2011). Marioni, J.C., Mason, C.E., Mane, S.M., Stephens, M. & Gilad, Y. RN
Slide 32: NextSeq 500システム：実機はラボにて見学可能
NextSeq 500システム：実機はラボにて見学可能 RNA Seq トレーニングも実施中 32 32
Slide 33: CRD YNEDOCSWELL
CRD YNEDOCSWELL illumina