Slide 1: 予算申請ウェビナー ウイルス、微生物編
予算申請ウェビナー ウイルス、微生物編 イルミナ株式会社 マーケティング本部 プロダクトマーケティング部 © 2016 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cBot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, ForenSeq, Genetic Energy, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium,
Slide 2: 本日の内容
本日の内容 次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成 ウイルス・微生物アプリケーションの紹介 – 微生物全ゲノム解析 – ウイルスゲノム解析 – メタゲノム解析 最適なNGSシステムの選び方 2
Slide 3: RERY—TUY—EGMT OMRat HSK
RERY—TUY—EGMT OMRat HSK illumina’
Slide 4: 次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成
次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成 研究目的、研究方法など – 研究の学術的背景、研究課題の核心をなす学術的「問い」 – 研究の目的および学術的独自性と創造性 – 研究で何をどのように、どこまで明らかにしようとするのか 研究経費とその必要性 – 設備備品の明細 – 消耗品費の明細 – 設備備品、消耗品費の必要性 4
Slide 5: 次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成
次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成 研究目的、研究方法など – 研究の目的： 疾患と関係する微生物の同定とメカニズムの理解 – どのように： メタゲノム解析による微生物のスクリーニング後、 特定した原因菌の全ゲノム解析 – どこまで： 疾患を引き起こす遺伝子の特定 研究経費とその必要性 – 設備備品： 次世代シーケンサー（既存・新規） – 消耗品費： シーケンス試薬、ライブラリー調製キット 研究計画調書作成に必要な情報をご提供 5
Slide 6: ウイルス、微生物研究におけるNGSの活用例
ウイルス、微生物研究におけるNGSの活用例 生物学 公衆衛生 医学 農学・環境 有用微生物の同定 原因菌の同定 健康・治療 環境調査 機能遺伝子解析 感染経路の特定 との関連性 モニタリング メカニズムの解明 全ゲノム解析・メタゲノム解析 6
Slide 7: NGSが活用されているアプリケーション
NGSが活用されているアプリケーション 微生物ゲノム解析 ウイルスゲノム解析 メタゲノム解析 特定の微生物、ウイルスの解析 微生物群集の解析 全ゲノムの配列情報 微生物群の種類の同定 遺伝子機能解析 存在比率の推定 分子系統樹の作成 特定微生物菌種の同定 感染経路の特定 環境と微生物叢の関係性の解明 病原性遺伝子の同定 バイオマーカーの発見 7
Slide 8: 微生物向けアプリケーションに求められる条件
微生物向けアプリケーションに求められる条件 微生物ゲノム解析 ウイルスゲノム解析 メタゲノム解析 ゲノムサイズ 数Mb 数Kb - 単離培養 必要 必要/不要 不要 リード長 300bp以上 300bp以上 500bp以上 ゲノムサイズの ゲノムサイズの データ量 10万リード 30～100倍 100倍以上 アプリケーションに最適な装置、試薬を選択 8
Slide 9: イルミナNGSを利用した微生物研究ワークフロー
イルミナNGSを利用した微生物研究ワークフロー サンプル ライブラリー作製 シーケンス データ解析 Or ゲノムDNA ライブラリー Or シーケンサー 調製キット トータルRNA 最適なワークフローと機器、消耗品をご紹介 9
Slide 10: 本日の内容
本日の内容 次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成 ウイルス・微生物アプリケーションの紹介 – 微生物全ゲノム解析 – ウイルスゲノム解析 – メタゲノム解析 最適なNGSシステムの選び方 10
Slide 11: EWE / L FRAT
EWE / L FRAT illumina’
Slide 12: 微生物の特定遺伝子の同定は全ゲノム解析から
微生物に存在する特定の遺伝子を同定するには 全ゲノム解析から始めるのが近道 ドラフトゲノム解析 • 複数株に対してNGSを用いて網羅的に全ゲノ ム解析を実施 分子系統樹解析 • 株同士のゲノム配列を比較して特異的な配列、 遺伝子を同定 同定遺伝子をサブタイピング • 同定した遺伝子に対するプライマー配列を設 計しサブタイピングを実施 12
Slide 13: 採択研究事例
採択研究事例 1. MiSeqとNextera XTを用いたドラフトゲノム配列の取得 2. 全ゲノム高解像度系統樹解析 3. Stx2ファージサブタイピング 4. Stx2産生量の定量 科学研究費助成事業データベース：九州大学大学院 医学研究院 細菌学分野 小椋 義俊 先生 https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-25460542/ 13
Slide 14: 解析目的に合わせて全ゲノム解析手法を選択
解析目的に合わせて全ゲノム解析手法を選択 既知微生物種の変異解析 • リシーケンス法 リードを参照ゲノム配列にアライメントする • サンプルあたり30x以上を推奨 参照ゲノム配列 Repeat Repeat 新規微生物種解読、既知微生物種に導入された遺伝子の探索 • de novoアセンブリ法 リード同士の配列を繋ぎ合わせる • サンプルあたり100x以上を推奨 コンティグ配列 メイトペア ライブラリー 14
Slide 15: ライブラリー調製キットのワークフローの比較
ライブラリー調製キットのワークフローの比較 リシーケンス法 de novoアセンブリ法 Nextera XTライブラリー調製キット Nextera Mate Pair ライブラリー調製キット 15
Slide 16: 微生物全ゲノム解析のワークフローとコスト
微生物全ゲノム解析のワークフローとコスト 3Mbの生物種を想定した場合 ライブラリー作製 シーケンス データ解析 消耗品費 リシーケンス サンプルあたりのデータ量 90Mb以上 (30x) Nextera XT DNA MiSeq Reagent Kit MiSeq Reporter MiSeq 1ラン Sample Prep Kit v2 (300 Cycle) Resequencing （48サンプル） (変異検出) 1サンプル 1サンプル 1サンプル ¥ 6,000 ¥ 3,938 無償 合計 ¥ 9,938* de novoアセンブリ サンプルあたりのデータ量 300Mb以上 (100
Slide 17: Prokka Genome Annotationでアノテーション
Prokka Genome Annotationでアノテーション 17
Slide 18: 微生物全ゲノム解析に必要な消耗品
微生物全ゲノム解析に必要な消耗品 カタログ番号 製品名 希望販売価格 リシーケンス ライブラリー調製キット FC-131-1096 Nextera XT DNA Sample Prep Kit（96 Samples） 546,000 FC-131-2001 Nextera XT Index Kit v2 Set A（96 Indices, 384 Samples） 179,000 シーケンス試薬キット MS-102-2002 MiSeq Reagent Kit v2（300 Cycles） 189,000 FC-420-1004 MiniSeq Mid Output Kit（300 Cycle
Slide 19: 微生物全ゲノム解析のまとめ
微生物全ゲノム解析のまとめ 微生物の機能解析の方法 – 複数株に対してNGSを用いた全ゲノム解析を実施 – 複数株を用いて分子系統樹解析を実施 – 特異的な遺伝子または配列を同定 全ゲノム解析の方法は2種類 – 既知微生物種の変異解析にはリシーケンス法 – 新規微生物種解読、既知微生物種に導入された遺伝子の探索にはde novoアセンブリ法 19
Slide 20: DAWA) Lit illumina’
DAWA) Lit 20 illumina’
Slide 21: 単離培養の可否に応じて２つの解析手法を選択
単離培養の可否に応じて２つの解析手法を選択 単離培養が可能な場合 単離培養が困難な場合 – インフルエンザウイルスなど – 臨床サンプル – ノロウイルスなど 解析方法 解析方法 – 単離培養したウイルスから – 臨床サンプルからTotal RNA抽 RNAを抽出して、逆転写した 出した後、ホストおよび細菌の cDNAを用いてゲノム解析を実 rRNAを除去した残りのRNAを 施 シーケンス – RNAウイルス配列だけを抽出 して解析 21
Slide 22: 採択研究事例
採択研究事例 1. 胃腸炎事例についてNGSを用いたメタゲノム解析を実施 2. 公定法では陰性だった検体からノロウイルスを検出 3. 牡蠣からは、複数のノロウイルス遺伝子型と他のウイルスを検出 科学研究費助成事業データベース：富山県衛生研究所 滝沢 剛則 先生 22 https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-25461530/
Slide 23: 臨床サンプルからの効率的にRNAウイルスをシーケンスするためのコツ
臨床サンプルからの効率的にRNAウイルスをシーケンス するためのコツ Total RNA中の80%以上を占めるホストおよび細菌の rRNAをシーケンス前に除去することが重要 Ribo-Zero Gold Epidemiology Kit ScriptSeq v2 RNA-Seqで ホストおよび細菌のrRNAを除去 ライブラリー調製 23
Slide 24: RNAウイルス解析のワークフローとコスト
RNAウイルス解析のワークフローとコスト ライブラリー作製 シーケンス データ解析 消耗品費用 単離培養が困難な場合 ウイルスとホストの両方のRNAをシーケンス (500万リード) ScriptSeq Complete BaseSpaceアプリ MiSeq Reagent Kit MiSeq 1ラン Gold Kit Krakenでの解析 (Epidemiology)+ v3 (150 Cycle) （6サンプル） (4 iCredit) ScriptSeq Index PCR 1サンプル 1サンプル 1サンプル 1サンプル ¥ 24,349 ¥ 27,000 合計 ¥ 51,349 約 ¥
Slide 25: 低スループットキットでも複数サンプル解析可能
単離培養が可能なウイルス種のゲノム解析は 低スループットキットでも複数サンプル解析可能 ゲノムサイ リシーケンスの 試薬キット シーケンス 装置 サンプル数 ズ 推奨データ量 （データ量） 単価 V2 Nano 24 2,175円 (300Mb) MiSeq V2 Micro 10Kb 100x 98 825円 (1.2Gb) Mid Output MiniSeq 196 506円 (2.4Gb) 25
Slide 26: ウイルスゲノム解析に必要な消耗品
ウイルスゲノム解析に必要な消耗品 カタログ番号 製品名 希望販売価格 単離培養が可能な場合 ライブラリー調製キット FC-131-1024 Nextera XT DNA Sample Prep Kit（24 Samples） 144,000 FC-131-2001 Nextera XT Index Kit v2 Set A（96 Indices, 384 Samples） 179,000 シーケンス試薬キット MS-103-1002 MiSeq Reagent Micro Kit v2（300 Cycles） 79,200 MS-103-1001 MiSeq Reagent Nano Kit
Slide 27: ウイルスゲノム解析 まとめ
ウイルスゲノム解析 まとめ 次世代シーケンサー利用のメリット – 既存法では不検出とされたサンプルからもウイルスが検出可能 – サンプル内に複数の遺伝子型を持つウイルスの同定も可能 ウイルスゲノム解析手法は2種類 – 単離培養の可否により解析手法が異なる RNAウイルス解析に最適なシステム – 比較的短いリード長で実施可能なため、MiniSeqでも十分に解析可能 – 単離培養が可能なウイルス種を解析する場合は、MiSeqの低スループット 試薬キットの利用でトータルコストを抑えることが可能 27
Slide 28: ABP LAT illumina’
ABP LAT 28 illumina’
Slide 29: メタゲノム解析の用途
メタゲノム解析の用途 ヒトマイクロバイオーム 環境メタゲノミクス 人の体内および表面に存 環境サンプルに存在する 在する微生物群の研究 微生物群の研究 人の健康および罹患状態 農学的、生態学的改善ま における微生物の役割の たは生物学的調査 理解 29
Slide 30: ヒトマイクロバイオーム研究例
ヒトマイクロバイオーム研究例 肥満 • 菌叢の多様性が低い傾向 • Chatelier E. et al, Nature (2013) 糖尿病 • マーカー遺伝子の同定 • Junjie Qin et al, Nature (2012) 大腸癌 • マーカー菌種の同定 • Zeller G et al, Mol Syst Biol. (2014) • Zackular J et al. Can Prev Res. (2014) 肝癌 • 肝癌誘発菌種の同定 • Yoshimoto et al. Nature (2013) 食生活 • 人工甘味料による耐糖能異常 • Suez J. et al.
Slide 31: メタゲノム解析で用いられる2つの手法
メタゲノム解析で用いられる2つの手法 16s rRNA解析 ショットガン解析 16s rRNA遺伝子はウィルスを サンプル中に含まれるゲノム 除くすべての微生物に存在 および転写物をシーケンス 16s rRNA遺伝子のみをシーケ 微量にしか含まれない微生物、 ンス ウイルスの同定が可能 16s rRNAの配列は多様性を持 種の同定だけでなく遺伝子解 つため、配列情報からサンプ 析も可能 ルに含まれる微生物の同定が 可能 31
Slide 32: 解析目的に応じて2つの解析手法を選択
解析目的に応じて2つの解析手法を選択 16s rRNA解析が有用なケース – 微生物の菌種および存在の検出 ショットガン解析が有用なケース – 微生物およびウイルスの両方を検出 – 微量にしか存在しない微生物の検出 – 微生物の機能性 / 病原性遺伝子の検出および機能 予測 32
Slide 33: メタゲノム解析のワークフローとコスト
メタゲノム解析のワークフローとコスト ライブラリー作製 シーケンス データ解析 消耗品費用 16S rRNA解析 サンプルあたり10万リード BaseSpace アプリ Nextera Index Kit MiSeq Reagent Kit MiSeq 1ラン 16S Metagenomics v3 (600 Cycle) （96サンプル） (1 iCredit) 1サンプル 1サンプル 1サンプル 1サンプル ¥ 474* ¥ 2,875 合計 ¥ 3,349 約 ¥ 50 ショットガン解析 サンプルあたり1,000万リード BaseSpaceアプリ Nextera XT DNA MiSeq
Slide 34: 16S rRNA解析では300bp×2を推奨
16S rRNA解析では300pbx2を推奨 341F 805R V3-V4領域 300 bp PEでオーバーラップ シーケンス 341F 805R 150 bp PEではV3領域しか読めない V4領域 515F シーケンス 806R 150 bp PEでオーバーラップ 34
Slide 35: BaseSpace 16S Metagenomics Appなら
BaseSpace 16S Metagenomics Appなら 複数サンプルの比較解析も簡単 タクソノミー階層ごとの分類 16S Metagenomics App 微生物多様性指標 ・イルミナ開発・サポート している解析アプリ 主座標解析（PCoA） 系統樹解析 35
Slide 36: ショットガン解析では1000万リード以上を推奨
ショットガン解析では1000万リード以上を推奨 NextSeqなら低コストで実施可能 試薬キット リード数 装置 サンプル数 シーケンスコスト （リード数） High Output MiniSeq 2 87,000円 (2,500万) V3 MiSeq 2 81,000円 (2,500万) 1,000万 Mid Output 10 19,100円 (1.3億) NextSeq High Output 30 16,700円 (4億) 36
Slide 37: メタゲノム解析に必要な消耗品
メタゲノム解析に必要な消耗品 カタログ番号 製品名 希望販売価格 16S rRNA メタゲノム解析 ライブラリー調製キット FC-131-2001 Nextera XT Index Kit v2 Set A（96 Indices, 384 Samples） 179,000 シーケンス試薬キット MS-102-3003 MiSeq Reagent Kit v3（600 Cycles） 276,000 ショットガンメタゲノム解析 ライブラリー調製キット FC-131-1096 Nextera XT DNA Sample Prep Kit（96 Samples） 546,000 FC-131-200
Slide 38: メタゲノム解析 まとめ
メタゲノム解析 まとめ メタゲノム解析の用途は2種類 – ヒトの健康や疾患と微生物との関係を研究するヒトマイクロバイオーム – 土壌や河川などに生息する微生物群を研究する環境メタゲノミクス 研究トレンド – 免疫疾患と腸内細菌叢との関連を調べるヒトマイクロバイオーム研究課題 の採択が増加 メタゲノム解析のアプローチは2種類 – 16s rRNA解析とショットガン解析 メタゲノム解析に最適なシステム – V3-V4領域をターゲットとする16S rRNA解析の場合はMiSeqが必須 – 多数のリード数が必要なショットガン解析の場合はNextSeqが有利 38
Slide 39: 本日の内容
本日の内容 次世代シーケンサーを活用する研究計画調書作成 ウイルス・微生物アプリケーションの紹介 – 微生物全ゲノム解析 – ウイルスゲノム解析 – メタゲノム解析 最適なNGSシステムの選び方 39
Slide 40: NGSシステムの選び方
NGSYATFLOBUA 40 illumina’
Slide 41: イルミナベンチトップシーケンサーのスループット比較表
微生物、ウイルスゲノムはゲノムサイズが小さい ためベンチトップシーケンサーが最適 イルミナベンチトップシーケンサーのスループット比較表 MiniSeq MiSeq NextSeq 550 最大データ量 7.5 Gb 15 Gb 120 Gb 最大リード長 150bp x 2 300bp x 2 150bp x 2 最大クラスター数 2,500万 2,500万 4億 Gbあたりのコスト 37,200円 18,400円 6,675円 本体価格 824万円 1,650万円 4,580万円 41
Slide 42: 微生物、ウイルスゲノム解析に必要な設備費用
微生物、ウイルスゲノム解析に必要な設備費用 カタログ番号 製品名 希望販売価格 MiniSeqシステム SY-420-1001 MiniSeq システム 1 年保証付 8,240,000 20004132 Illumina Product Care MiniSeq Basic Plan 800,000 MiSeqシステム SY-410-1003 MiSeq システム 1 年保証付 16,500,000 SV-420-1002 Illumina Product Care MiSeq Basic Plan 2,260,000 NextSeqシステム SY-415-1002 NextSeq 550
Slide 43: BaseSpace Sequence Hubサービス一覧
データ解析は初期コスト不要のクラウドサービス BaseSpace Sequence Hubサービス一覧 ベーシック プロフェッショナル エンタープライズ ライセンス費用 無償 無償 お問い合わせ 標準ストレージ 1TBまで 1TBまで 1TBまで 追加ストレージ(有償) 不可 可 可 初期付与ポイント 250 iCredit*1 250 iCredit*2 250 iCredit*2 無償アプリ利用 可 可 可 有償アプリ利用 不可 可*3 可*3 グループ利用 ✔ ✔ プロフェッショナル ✔*4 ✔ サービスサポート プライベートドメイン、 ✔ シングルサインオン *1. アカウント作成後、
Slide 44: まとめ
まとめ 微生物研究の目的、目標に応じて適切な研究計画の策定 – 生物種、サンプル数、NGSのアプリケーション 代表的なNGSアプリケーション – 微生物、ウイルスの全ゲノム解析 – メタゲノム解析 微生物、ウイルス研究に最適なシステム – ゲノムサイズが小さいのでベンチトップ型がお勧め – 長いリードを必要とするアプリケーションが多数存在す るため、MiSeqを中心に装置を選択 最適なデータ解析環境はBaseSpace Sequence Hub – 微生物解析用のアプリを多数搭載 – 利用料は解析した分だけお支払 44
Slide 45: ご静聴ありがとうございました。
ご静聴ありがとうございました。 製品のお見積に関するお問い合せ先 イルミナ株式会社 営業本部 Sales_JPN@illumina.com 45